槲皮素对宫颈癌细胞C33A增殖和凋亡的影响

槲皮素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，具有免疫调节、抗菌、抗病毒以及清除自由基等多种作用[1]。研究[2-5]表明，槲皮素可有效抑制乳腺癌、结肠癌、肝癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞的增殖。同时，槲皮素还可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，可与其他化疗药物联合用于肿瘤的化学治疗[6-10]。

因此，本研究通过槲皮素作用于人宫颈癌C33A细胞,研究槲皮素对C33A细胞增殖及凋亡的影响，并初步探讨其相关作用机制，为临床槲皮素治疗宫颈癌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人子宫颈癌细胞系C33A购自武汉普诺赛生命科技有限公司(CL-0045)。 槲皮素购于Sigma公司(Q4951)，顺铂购于Sigma公司(479306-1G)， DMEM培养基购于Gibco公司(12100-046)，胎牛血清购于HyClone公司(SH30070.04)，Cyclin D1鼠单克隆抗体(sc-20044)、Caspase-3鼠单克隆抗体(sc-273503)、Caspase-9鼠单克隆抗体(sc-273525)和β-actin鼠单克隆抗体(sc-130656)均购于Santa Cruz公司，二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide， DMSO)购于Sigma公司(D-2678)，噻唑蓝染液(thiazole blue，MTT)购于Sigma公司(BR-03955)，其余为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人宫颈癌C33A细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，置于含5%CO2 的37℃孵箱中常规培养, 每3～4 d用胰酶消化、传代1次。

1.2.3 MTT法检测细胞活力 C33A细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液，按照4×104个/孔的细胞浓度接种于96孔板中，每孔加入200 μL 1640培养液。待细胞贴壁后,换为含有不同浓度的槲皮素和顺铂培养液培养。各孔细胞在培养24 h和48 h后，吸弃培养液，分别加入100 μL MTT(5 g/L)，37℃孵育4 h后吸弃上清液；再分别加入150 μL DMSO，混匀后测定490 nm波长处每孔的光密度值(optical density，OD) ，每组均设置3个复孔。细胞活力计算公式：细胞活力(%)=(槲皮素组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2 药物配置与实验分组 将241.792 mg槲皮素溶于10 mL DMSO中作为备用母液，-20℃保存备用。实验时，将1 mL母液加入999 mL DMEM培养液稀释为80 μmol/L，之后分别等倍稀释为20、40 μmol/L，DMSO的最终浓度<0.1%。将C33A细胞分为对照组(1640培养基+DMSO)、槲皮素组(20、40和80 μmol/L)、顺铂组(5、10、15、20 μg/mL)、联合组(槲皮素40 μmol/L+顺铂 10 μg/mL[11])。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 C33A细胞经胰酶消化后，接种于6孔板中，待细胞贴壁后, 更换为含有不同浓度(空白对照、20、40和80 μmol/L)槲皮素的培养液中。48 h后收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min后，吸弃上清，加入70%酒精4 ℃固定12 h。再次离心，用含0.01% RNase的碘化丙啶(propidium iodide，PI)避光染色30 min后，上机检测。通过CellQuest软件分析结果，每组均设置3个复孔。

青海汉话受到德都方言的影响不仅表现在语音方面，而且在词汇方面也是十分明显的，主要是吸收了不少蒙古语词，其中，有一些借词已经成为青海汉话的基本词汇，被广泛运用于日常言语交际之中，甚至有的已经成为青海汉话的构词语素，具有了构造新词的能力。例如：青海汉话的“阿蒙”一词是德都蒙古语的“”yamar[jamar]，表示“什么、怎么”义，由此构成了“阿蒙做”(怎么做)、“阿蒙价”(怎么能)、“阿蒙个”(怎么样地)、“阿蒙了”(干什么、怎么样)、“阿蒙办”(怎么办)几个德都方言借词。现撷取几个比较典型的蒙古语借词与德都方言做一对比：

1.2.5 Western Blot检测蛋白表达 C33A细胞经胰酶消化后，接种于6孔板中，待细胞贴壁后, 更换为含有不同浓度(空白对照、20、40和80 μmol/L)槲皮素的培养液中。48 h后收集细胞，裂解并测定各组细胞的蛋白浓度，行SDS-PAGE分离蛋白。电泳结束后，将膜移至含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1 h，TBST洗膜10 min×4次。加入一抗，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，用检测液行发光反应，于暗室中曝光，通过Image J软件进行灰度分析，计算蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0对数据进行统计分析,计量资料用表示，多组均数比较采用单因素方差分析，有差异使用Dunnett-t检验进行两两比较，两组间均数比较采用t检验,重复测量数据用重复测量资料的方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，包括芸香苷和槲皮苷2种糖基化形式，广泛分布于水果、蔬菜及多种中草药中。研究[1-3]表明，槲皮素有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎以及保护心血管等功能。本研究中，宫颈癌细胞C33A经不同浓度槲皮素作用24 h和48 h后，C33A细胞活力同空白对照组相比出现了明显的下降。上述结果表明，随着槲皮素作用浓度的升高以及时间的延长，槲皮素抑制C33A细胞的能力也在增强。

施剑明等[12]研究发现，槲皮素可影响人骨肉瘤MG-63细胞的增殖及凋亡，，与顺铂联合有协同效应。本研究中，两者联合作用于C33A细胞24 h和48 h后，细胞活力分别为(31.12±2.835)%和(17.86±3.182)%，作用效果强于相同条件下两者单独使用，提示槲皮素可增强顺铂对C33A细胞的敏感性，与顺铂具有协同效应。

表1 槲皮素及顺铂对C33A细胞活力的影响

组别浓度(μmol/L)24小时48小时对照组098.35±1.230a96.97±1.788b槲皮素组2086.92±3.953a165.19±7.071b14066.54±3.932a247.04±8.881b28052.21±2.970a329.71±6.505b3顺铂组585.97±4.455a466.10±7.234b41062.16±6.215a536.01±4.080b51535.25±2.984a624.88±3.917b62027.54±3.309a714.54±2.220b7联合组31.12±2.835a817.86±3.182b8F值108.131448.710P值<0.001<0.001

注：a vs a1(P=0.049)、a2(P<0.001)、a3(P<0.001)、a4(P=0.023)、a5(P<0.001)、a6(P<0.001)、a7(P<0.001)、a8(P<0.001)； b vs b1(P<0.001)、b2(P<0.001)、b3(P<0.001)、b4(P<0.001)、b5(P<0.001)、b6(P<0.001)、b7(P<0.001)、b8(P<0.001)

此外，细胞周期结果显示，C33A细胞经不同浓度(20、40和80 μmol/L)槲皮素处理48 h后，G0/G1期细胞百分比明显增加，而S期细胞百分比则出现明显下降(P<0.05)。上述结果表明，槲皮素可增加G0/G1期细胞数量，同时减少S期细胞数量，从而抑制C33A细胞的增殖。同时，Western Blot检测结果显示，槲皮素可下调C33A细胞周期相关蛋白Cyclin D1的表达。因此，推测槲皮素可能是通过下调细胞中Cyclin D1蛋白的表达，阻断细胞由G0/G1期向S期的转换，从而抑制C33A细胞的增殖和活力。

2.3 槲皮素对C33A细胞Cyclin D1、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表达的影响 根据前期MTT的结果，在槲皮素浓度为40 μmol/L，作用时间为48 h的条件下，对C33A的细胞活力的抑制作用比较明显，而且细胞凋亡的作用也不至于过于强烈，因此选择该条件来检测槲皮素对蛋白表达的影响。与空白对照组(蛋白相对表达量分别为：0.315±0.024、0.082±0.019、0.070±0.006)相比，槲皮素(浓度为40 μmol/L)作用于C33A 细胞48 h后，Cyclin D1表达降低(0.152±0.002)，Caspase-3 和Caspase-9的表达增多(0.481±0.013、0.306±0.014)，差异均具有统计学意义(t=6.687、17.020、15.690，P=0.022、0.003、0.004)。详见图3。

本课题采用GC-MS法和UV254测定，对混凝-加核絮凝组合工艺处理前后麦草浆制浆造纸废水中污染物的成分进行了分析研究，并利用活性污泥法对组合工艺处理后的废水是否可以利用生物法继续处理做了验证。

图3 槲皮素对Cyclin D1、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表达的影响

表2 槲皮素对C33A细胞周期的影响

组别浓度(μmol/L)细胞周期G0/G1期S期G2/M期对照组047.07±2.404a29.41±2.114b22.90±1.252c槲皮素组2052.48±1.188a123.69±1.881b119.90±1.577c14060.30±1.874a220.41±3.111b218.17±2.567c28064.54±2.157a316.62±1.570b316.98±2.814c3F值5.89117.3509.310P值0.010<0.001<0.001

注： a vs a1(P=0.005)、a2(P<0.001)、a3(P<0.001)；b vs b1(P=0.018)、b2(P=0.001)、b3(P<0.001)；c vs c1(P=0.046)、c2(P=0.001)、c3(P<0.001)

3 讨论

2.1 槲皮素对C33A细胞活力的影响 经过槲皮素处理24 h后，各组细胞活力分别为(86.92±3.953)%(20μmol/L组)、(66.54±3.932)%(40μmol/L组)和 (52.21±2.970)%(80μmol/L组)，均低于空白对照组的(98.35±1.230)% ；经过槲皮素处理48 h后，各组细胞活力分别为(65.19±7.071)%(20μmol/L组)、(47.04±8.881)%(40μmol/L组)和 (29.71±6.505)%(80μmol/L组)，均低于空白对照组的(96.97±1.788)%。C33A细胞经过不同浓度的槲皮素处理后，细胞活力均低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；经不同浓度的顺铂(5、10、15、20 μg/mL)处理后C33A细胞的细胞活力也低于空白对照组(P<0.05)；此外，槲皮素40 μmol/L+顺铂 10 μg/mL联合作用于C33A细胞24 h后，细胞活力下降为(31.12±2.835)%； 48 h后，细胞活力下降为(17.86±3.182)%，低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2 槲皮素对C33A细胞周期的影响 C33A细胞分别经不同浓度(空白对照、20、40和80 μmol/L)槲皮素作用48 h后，G0/G1期细胞百分比为(47.07±2.404)%、(52.48±1.188)%、(60.30±1.874)%和(64.54±2.157)%，S期细胞百分比为(29.41±2.114)%、(23.69±1.881)%、(20.41±3.111)%和(16.62±1.570)%，差异均具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

高校突发事件带来的危害较大，当其一旦发生之后，必须对其采取有效的防护措施，以此来避免事件的进一步扩大，带来更大的经济损失。

Caspase-3 和Caspase-9作为凋亡信号转导通路中的关键蛋白，可以诱导细胞进入凋亡程序。有研究[13]证实，槲皮素可通过上调Caspase-3的表达，促进人膀胱癌细胞的凋亡。本研究中，Western Blot结果显示，槲皮素增加C33A细胞凋亡相关蛋白Caspase-3 和Caspase-9的表达。因此，推测槲皮素可能通过提高Caspase-3 和Caspase-9的表达，促进C33A细胞凋亡。

综上所述，槲皮素可能通过调节周期相关蛋白Cyclin D1以及凋亡相关蛋白Caspase-3 和Caspase-9的表达，抑制C33A细胞的增殖和活力；槲皮素还可以增强顺铂对C33A细胞的敏感性，与顺铂具有协同效应，相关作用机制还有待进一步研究。

孙子还提出，“故形人而我无形，则我众而敌寡，我专为一，敌分为十，是以十攻其一也。”可见，除了针对对方的弱点进行部署外，还应当注重削弱、分化对方的强点。比如在2018年雅加达亚运会的决赛比赛中，中国男篮所面对的伊朗队内线哈达迪是一名十分具有统治力的队员。中国男篮充分利发挥内线队员年轻，人员多的优势，轮番对哈达迪进行杀伤。在进攻上，积极冲击内线，让哈达迪疲于补防；在防守上，宁愿采取犯规战术来消耗其体能。最终哈达迪在第四节体能严重透支，使得中国男篮在大比分落后的情况下实现反超并最终取胜。

参考文献

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[13]SU Q, PENG M, ZHANG Y, et al. Quercetin induces bladder cancer cells apoptosis by activation of AMPK signaling pathway[J]. Am J Cancer Res,2016,6(2):498-508.

李顺说，李六如，你可真倔，住上楼也还是个土老帽。都说与时俱进，我看你就是块石头，你这样是要吃亏的。我说，我有和村里的合同，再说，我这么做与上头的精神也一致。上头不也号召把青山绿水留给子孙后代？