低氧胁迫对鲢心肌细胞凋亡及其调控基因Bax、Bcl-2表达的影响

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)是我国淡水养殖的主要种类之一，总产量居第二位，具有重要的经济价值。此外，鲢在水生生物资源养护、修复水域生态和促进渔业增效增收等方面也发挥重要作用[1-2]。但是，鲢性活跃、急躁，受到刺激后应激强烈，耐低氧能力差，养殖生产过程中容易发生泛塘，高密度运输过程中也容易发生低氧应激、死亡等现象，容易造成经济损失。了解低氧胁迫下鲢组织或器官的损伤情况及低氧情况下导致鲢死亡的原因可以为鲢抗低氧育种、养殖、运输等技术的研发提供指导。

“农三代”是吴躜辉身上一个闪亮的标签，2009年他毕业于浙江农林大学，刚一毕业就进入了浙江爱普农业科技发展有限公司工作，到今年已经整整十个年头了。说起选择农资行业的原因，吴躜辉说走进农资这个行业并不是他偶然的一个行为，而是经过深思熟虑后所做下的决定。

细胞凋亡，又被称为细胞程序性死亡，受特定基因调控，是机体组织为维持适宜的细胞数量而主动自杀的一种死亡方式，在机体正常发育、稳态的维持等过程发挥着重要作用。除此之外，凋亡还发生在许多外界因素诱导的生理和病理过程中：如免疫耐受、肿瘤监控、应激反应等[3]。有研究表明，低氧诱导的氧化应激与细胞凋亡关系密切，nmol水平的活性氧可促进细胞增生，μmol水平的活性氧会引起细胞凋亡，mmol水平的活性氧直接导致细胞死亡[4]。严重低氧胁迫下，氧化应激介导的细胞凋亡主要是由死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路三个互相联系的凋亡途径共同作用发生，NF-κB通路、p53通路等凋亡路径可能也参与调控[5-7]。鱼类机体组织或器官由高度分化的细胞组成，正常生理条件下，凋亡细胞数目较少，组织或器官的功能完整度高，一旦凋亡过度，必将影响其功能。目前，有研究表明低氧胁迫会诱导鲢脑细胞、肝细胞凋亡，团头鲂心脏组织结构变化及线粒体损伤，但是缺氧条件下鲢的心肌细胞损伤状况还未见报告，是否引起心肌细胞凋亡及凋亡机制也需要了解[8-10]。为此，采用密闭鱼缸自发耗氧的方法模拟缺氧环境，首先通过检测不同低氧条件下鲢血清肌酸激酶(Creatine kinase，CK)的活力判定心肌损伤情况，然后通过TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色法检测心肌细胞的凋亡情况，进一步用qPCR检测凋亡调控基因Bax、Bcl-2在心脏组织中表达量的变化，为缺氧诱导的鲢心肌损伤和鲢养殖、运输、抗低氧育种等研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用鲢购于重庆市沙坪坝区双连水库，体长为(23.1±0.8)cm，体重为(212.3±17.2)g。经15 d暂养适应后挑选外观健康，活力正常，规格一致的鲢用于实验。实验开始前先将实验鱼在实验鱼缸中适应24 h，气泵通气维持氧浓度。

1.2 实验设计

以曝气并通空气的自来水为实验用水，将暂养后的鲢随机分为3组，常氧对照组(Normoxia group，NO)、两个低氧胁迫实验组，分别放入120 L的圆形鱼缸中，每组设3个平行，每缸放入16尾，总计9缸144尾。实验水温控制在(23.0±1.0)℃，实验组用保鲜膜和塑料盖密封，NO组持续通空气。两组实验组，其中一组为浮头实验组(Hypoxia group，HO)，至实验鱼全部浮头时采样，为实验开始后约4 h，DO值为(1.19±0.17)mg/L。另一组为死亡实验组(Asphyxia group，AO)，到实验鱼半数死亡时采样，为实验开始后约12 h，DO值为(0.38±0.13)mg/L。取样前用150 mg/L的MS-222麻醉实验鱼以降低应激反应。

反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，引物退火温度退火20 s，反应40个循环，72 ℃延伸32 s。内参引物为1α-F：5′-TGGGTCGTCCTTGCTGTCT-3′，1α-R：5′-CCCTGCCAACATTACCACTG-3′，做标准曲线分析凋亡调控基因Bax、Bcl-2的表达变化。

1.3 样品采集与制备

各组随机取15尾活鱼测量体长、体重，然后用一次性灭菌注射器从尾静脉取血，室温静置2 h，待其凝固后3 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液制备血清。取血后迅速进行解剖取样，取其心脏称重，每组取5尾鱼的心脏用4%多聚甲醛溶液固定用于检测细胞凋亡情况，其余的用液氮研磨，然后用灭菌锡箔纸包裹液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱以备检测凋亡基因表达。

1.4 实验方法

凋亡调控基因Bax、Bcl-2的表达变化采用荧光定量PCR检测。首先，用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取冻存的心脏组织总RNA，然后按照Fast Quant RT Kit(with gDNase)(天根生化科技有限公司)操作说明合成cDNA，并根据基因Bax、Bcl-2的序列用Primer Premier5.0设计引物荧光定量PCR所用引物，Bax-F1：5′-CTCTGCTCTTCAACCGACTC-3′，Bax-R1：5′-CGGCACGCAAAGTAGAAA-3′，退火温度55 ℃；Bcl-2-F1：5′-GCGCAACGCAGCTTCTTA-3′，Bcl-2-R1：5′-GGCATCCCAACCTCCATT-3′，退火温度59 ℃。荧光定量PCR采用三步法在BIO-RAD CFX ConnectTM Optics Module荧光定量PCR仪中进行，反应体系见表1。

心肌细胞凋亡用TUNEL染色法[11]对心肌细胞切片进行处理，用Leica DM6000B全自动荧光显微镜进行观察照相，随机选取视野对凋亡细胞进行计数，计算凋亡指数。

(2)Do not make your contribution more informative than is required.

血清CK活力采用日立7020全自动生化分析仪检测，检测程序按照南京建成生物工程研究所生产的肌酸激酶(CK)测定试剂盒说明书设置。

TUNEL法组织学观察结果如图1所示，与NO组相比，随着氧浓度的降低，实验组鲢心肌组织中正常细胞数目减少，凋亡细胞数目增加，表明低氧胁迫加剧了细胞凋亡的发生。NO组的鲢心肌正常细胞数目远大于凋亡细胞数目，HO组正常细胞和凋亡细胞细胞数目较为接近，AO组则是正常细胞远小于凋亡细胞数目。对凋亡细胞计数后的结果表明：NO组细胞凋亡指数为7.69±2.96，HO组细胞凋亡指数为47.94±1.87，AO组细胞凋亡指数为85.39±2.61，三组间差异极显著(P<0.01)。

表1 荧光定量PCR反应体系 Tab.1 Reaction system for qPCR

组分用量2xSuperRealPreMix10μL上游引物F(10μmol/L)0 6μL下游引物R(10μmol/L)0 6μLcDNA模板2 0μLddH2O6 8μL总反应体积20μL

2)多种检测技术相结合拓展了NMR在植物研究领域的应用，不仅简化了样品前处理过程，而且能够提高自动化程度，全面准确地发掘更多信息，例如LC-NMR技术、LC-SPE-NMR和LC-MS-NMR技术等，但NMR常规的室温探头检测灵敏度只有毫克级，而色谱、质谱达到了微克级，限制了联用技术的广泛应用。针对这一问题，使用超低温微量探头及提高磁场强度可较好的解决这一缺陷[50]，探头类型相同的情况下，600 MHz比200 MHz谱仪的31P、1H、13C 3种核的检测灵敏度提高约3～7倍，同时，使用超低温微量探头比同频率的常温探头的检测灵敏度高3～5倍。

1.5 数据分析

用实时荧光定量PCR的方法研究了常氧和不同低氧胁迫下鲢心肌凋亡调控基因Bax、Bcl-2的表达水平，结果如图3所示。与NO组相比，低氧胁迫后的HO组和AO组Bax基因表达量增加，AO组表达水平显著高于NO组和HO组(P<0.05)，表明低氧胁迫激活了促凋亡基因使其表达量上升；Bcl-2的表达量逐渐下降，各组间差异显著(P<0.05)，表明了低氧胁迫抑制的抗凋亡基因的表达；Bcl-2/Bax随着氧浓度的降低而下降，组间差异显著(P<0.05)，表明氧浓度越低鲢心肌细胞凋亡趋势越显著。

2 结果与分析

2.1 低氧胁迫下鲢血清CK活力升高

从表2的结果可以得出，经过不同程度的低氧胁迫后，鲢血清中CK活力随着氧浓的降低而升高，且低氧胁迫下的两个实验组与NO组比较差异显著(P<0.05)，表明鲢心肌细胞可能产生了损伤。但从HO组处理至AO组时，血清CK活力略有升高，两组间差异不显著。

表2 低氧胁迫下鲢血清CK活力变化 Tab.2 Changes of serum CK activities in H.molitrix under hypoxia stress

组别NO组HO组AO组肌酸激酶/(U·L-1)3555 33±137 08a5419 50±21 92b5733 50±16 26b

注：肩注中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 低氧胁迫显著增加鲢心肌细胞凋亡数目

搞生态文明建设离不开水，然而河北省是一个极度资源性缺水的省份。多年平均降水量532 mm，人均水资源占有量307 m3，为全国平均值的1/7。南水北调中线工程将于2014年汛后通水，每年可为河北提供30.4亿m3用水量。这些宝贵的水资源将对河北植树造林，净化空气，治理雾霾产生积极影响。因此，很有必要对南水北调中线工程对治理雾霾产生的影响进行认真分析，以引起有关部门的重视，并做好相关工作，使这些来之不易的水资源为治理雾霾充分发挥作用。

图1 TUNEL法检测低氧胁迫下鲢心肌细胞凋亡的结果 Fig.1 The results of cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL under hypoxia stress in H.molitrix 长箭头所指为正常细胞(蓝色细胞核)，短箭头所指为凋亡细胞(棕褐色细胞核)；放大倍数为400x。

2.3 低氧胁迫升高Bax表达、降低Bcl-2表达

2.3.1 心肌细胞总RNA质量检测

“太好了，丁达，你还活着？”镜心羽衣沉浸在幸存的兴奋中，并未在意丁达的玩笑，她推了推旁边的壶天晓， “天晓，丁达还活着！”

实验所提取的心肌总RNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.9 ～ 2.1之间，表明纯度较好。1 % 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，可以看到表示28 S、18 S、5 S的三条亮带，且28 S亮带亮度比18 S亮，表明RNA完整性较高。

图2 鲢心肌总RNA电泳检测结果 Fig.2 Electrophoresis results of total RNA of cardiomyocyte in H.molitrix

2.3.2 心肌中基因Bax、Bcl-2的表达变化

实验数据利用Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行处理，以平均值±标准误表示，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)法分析，用LSD和Dunnett’s T3进行组间差异比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

图3 低氧胁迫下鲢心脏细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA表达量的变化 Fig.3 The mRNA expression changes of apoptosis related gene Bax and Bcl-2 under hypoxia stress in H.molitrix heart 常氧对照组表示常氧对照组，浮头实验组表示实验鱼全部浮头时期，死亡实验组表示半数实验鱼死亡时期。不同小写字母表示低氧处理不同时期同一基因mRNA的差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 低氧胁迫对鲢血清CK活力的影响

溶解氧是影响鱼类生存、代谢、生殖、生长发育的重要环境因子。鲢正常生长发育的氧浓度为5.5 mg/L，当溶解氧低于1.75 mg/L时，呼吸会受到抑制，表现出浮头现象，当溶解氧低于0.26 ～ 0.79 mg/L时，会导致鱼窒息死亡[12]。CK广泛存在于脊椎动物心脏和肌肉组织中，在能量代谢过程中可以催化高能磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之间可逆性转移，对鱼类的生存具有重要作用。由于细胞破裂或坏死后会进入血液，血清CK也常被用来作为衡量心肌细胞损伤程度的指标[13]。鱼类对氧浓度较为敏感，特别是鲢，在遭受低氧胁迫时，CK活力必然会受到影响。由实验结果可知，与NO组相比，鲢血清CK活力在HO组和AO组显著升高，这与区又君等[14]对卵形鲳鲹的研究结果一致，表明低氧胁迫可能造成了鲢心肌损伤。鱼类对不利环境有一定的适应性，面对低氧胁迫也是如此，鱼体抗氧化系统会根据环境调控自身的生理以维持生存[15]。低氧胁迫实验组中，HO组与AO组比较，血清CK活力差异不显著，这可能是鲢对低氧胁迫环境具有一定的耐受性所致。但是，目前鲢的低氧耐受机制还不完全清楚。

3.2 低氧胁迫与细胞凋亡

经过漫长的生物进化后，鲢自身形成了一套精密的对抗低氧胁迫的机制，细胞凋亡是这套机制中的组成部分。鱼类对低氧的耐受性取决于自身的生理调控能力，低氧可以引起细胞线粒体损伤，严重时导致细胞凋亡，缺氧超出阈值后则导致鱼类死亡，相关研究认为低氧胁迫下，脑细胞和心肌细胞的大量凋亡是导致鱼类死亡的主要原因[16]。心脏作为鱼体的供氧中枢，对氧的需求很大，敏感度较高，低氧或缺氧后，必定会对其功能和器质完整产生影响。本研究采用TUNEL染色法对鲢心脏组织进行了形态学观察，结果显示，低氧胁迫加重了心肌细胞的凋亡现象，且随着氧浓度的降低，凋亡细胞数目也在增加。此结果与吴鑫杰等[11]对团头鲂在低氧胁迫下心肌细胞凋亡的结果相同，与之有相似的结果在欧洲川鲽[17]、斑马鱼[18]上也有报道。赵金坤[8]研究了低氧胁迫下鲢脑细胞凋亡和肝细胞凋亡情况，结果显示低氧胁迫处理至浮头时，细胞凋亡数目显著升高，但浮头组与死亡组凋亡细胞数目差异不显著，并认为造成此差异现象的原因之一可能是低氧胁迫诱导细胞凋亡存在一个阈值，当超出阈值后，细胞凋亡在细胞死亡现象中所占比不再增加，而是由其他死亡方式代替[19]。此外，笔者认为鱼类由于在长期演化进程中会受到不同浓度溶氧水体的自然选择，形成了适应不同溶氧水环境的物种，甚至近缘物种间或同一物种不同品系间对低氧胁迫的适应能力都不相同，因此，鲢不同器官或组织对缺氧的耐受性也可能存在差异[20]。但低氧胁迫下的细胞凋亡不仅表现为形态学和生理上的变化，诸如细胞核凝集、细胞膜皱缩、DNA降解、凋亡小体形成等，深层次的变化更是涉及多种信号通路的调控。

3.3 低氧胁迫诱导凋亡调控基因Bax、Bcl-2表达变化

细胞凋亡作为生命的基本现象之一，广泛存在于多细胞生物的生命进程中。许多研究发现线粒体不仅为各种生命活动提供能量，在调控细胞凋亡中也具有中心调控作用[21]。线粒体凋亡通路表现为各种内外因素产生的胞内信号作用于Bcl-2蛋白家族改变线粒体膜的通透性，释放促凋亡物质，如细胞色素C(cyt C)、凋亡诱导因子(AIF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活蛋白(Smac/DIABLO)等，直接或间接导致细胞凋亡。Bcl-2基因和Bax基因是线粒体凋亡通路Bcl-2蛋白家族中具有对立功能的基因，分别表达为抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax。正常生理条件下，Bcl-2蛋白和Bax蛋白各自形成同源二聚体，其中Bcl-2蛋白主要存在于线粒体膜，Bax蛋白主要存在于细胞浆；当胞内产生凋亡信号(受到低氧胁迫)，Bax会易位至线粒体膜上与Bcl-2蛋白结合成更稳定的异源二聚体，抑制Bcl-2蛋白的抑凋亡作用。哺乳类研究表明，细胞Bcl-2基因高表达时，Bcl-2蛋白和Bax蛋白异源二聚体大量生成，抑制Bax蛋白的促凋亡作用；细胞Bax基因表达升高时，Bcl-2蛋白和Bax蛋白形成异源二聚体，阻止了Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用[22]。因此，抗凋亡基因与促凋亡基因表达量的比值一定程度上决定了细胞的发展方向。本实验研究结果显示，随着氧浓度降低至AO组水平，鲢心肌细胞Bcl-2基因表达量显著性降低，Bax基因表达量显著升高，Bcl-2/Bax的值也在逐渐减小，表明氧浓度降低至AO组水平时，细胞凋亡可能成为了鲢心肌细胞的主要发展方向，此结果与鳜鱼[23]、团头鲂[24]、斑点叉尾鮰[25]等低氧胁迫下Bcl-2和Bax基因表达量的变化趋势一致。但有研究表明，在慢性缺氧实验中，鲤[26]、斑马鱼[18]、斑点叉尾鮰等部分抗凋亡基因表达量也会升高，如斑马鱼的BI1、bnip3基因，斑点叉尾鮰的blp1、mcl1α基因，这可能与鱼类的自我保护机制有关，是不同鱼类适应低氧环境所采取的生存策略。

综上所述，低氧胁迫通过降低线粒体凋亡通路抗凋亡基因Bcl-2、升高促凋亡基因Bax，促使鲢心肌细胞凋亡，导致心肌损伤，随着溶解氧浓度的降低，鲢心肌凋亡现象越显著，心肌损伤越严重。细胞凋亡使存在于心肌细胞的CK释放进入血液，导致血液中CK活力升高。因此，低氧诱导的心肌细胞凋亡导致心肌损伤可能是鲢在低氧胁迫下死亡的重要原因。

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