南极低温降解卡拉胶菌株的筛选、鉴定、产酶条件及酶学性质的初步研究

卡拉胶降解酶是一种实用的水解卡拉胶的工具酶，能水解κ-卡拉胶的1，4-糖苷键，获得一系列不同分子量和组成的同源偶数寡糖[1]。相对卡拉胶而言,卡拉胶寡糖分子量更小、溶解性更好、黏度低，因而更利于机体吸收；同时因水解酶的作用，卡拉胶寡糖的活性基团显露出来，使得原有的活性得到提高，甚至具有了新的活性[2]。研究发现，卡拉胶寡糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化、抗凝血、免疫调节等多种功能[2-4]，在医药方面具有潜在的应用价值。卡拉胶寡糖也可在酸性条件下与亚硒酸钠反应合成硒化卡拉胶寡糖，硒含量达到30 μg·mg-1，可作为安全性高的有机硒的补充剂[5]。因此，卡拉胶寡糖本身以及其衍生物均具有科学研究价值以及实际应用价值。

1.2.2 训练内容 以汪波等［5］编制的“精神分裂症患者社会技能训练模式”为基础，内容适当简化和调整，尽可能符合患者的实际需要和方便易行，主要内容包括5个方面。

目前，降解卡拉胶获得卡拉胶寡糖的方法主要有化学试剂降解法、物理超声波降解法和微生物酶降解法[6]。化学试剂降解法主要用强酸、强碱或强氧化剂等试剂，存在试剂危险、反应剧烈、环境污染严重、产物纯化难等缺点，不适于工业化生产[7]。物理超声波降解法采用超声波处理，其应用条件受限，仅适于实验室应用，不适于工业化生产。微生物酶降解法反应条件温和、过程易于控制、环境污染少、降解产物单一，且酶具有底物特异性、专一性和高效性等优点[7]，微生物酶降解法已成为近年来的研究热点。

微生物是卡拉胶降解酶开发的重要来源，筛选新的产卡拉胶降解酶微生物是有效利用卡拉胶的关键。目前发现的产卡拉胶降解酶菌株主要是假单胞菌属(Pseudomonas carrageenovora)、噬纤维菌属(Cytophaga)、别单胞菌属(Alteromonas carrageenovora)、弧菌属(Vibrio) 等微生物[8-12]。

作者从6种南极海藻中分离得到1株κ-卡拉胶降解菌，并对其进行了菌种鉴定、产酶条件优化以及酶学性质的初步分析。

1 实验

1.1 菌株与培养基

王祥在L市里无亲无故，也没个人给他当个导游，去当铺，他害怕像电视里的大头鬼一样被骗了。去商场，他又估摸着那里只有东西买，没有地方卖。他想来想去突然想起电视里播过城里专门有古玩交易市场，于是便抱着试试看的心态去看了看，一看之下王祥大吃一惊。

富集培养基(g·L-1)：蛋白胨5，酵母粉1，海水配制。

筛选固体培养基(g·L-1)：蛋白胨5，酵母粉1，卡拉胶15，琼脂粉15，海水配制。

1.2 菌种的筛选

将6种海藻(胶管藻、亮管藻、舌状蜈蚣藻、海萝、叉枝藻、石菜花)在培养箱中富集培养。将富集的菌液用无菌生理盐水稀释至合适的浓度，涂布于筛选固体培养基上，培养24 h；挑取单菌落划线至筛选固体培养基上；重复3～4次后用卢戈氏碘液进行染色，观察菌落周围是否出现透明圈或者明显的凹陷，同时将单菌落挑至2216E斜面培养基于-4 ℃保存。

1.3 卡拉胶降解酶的活性测定

采用DNS法[11,13]测定卡拉胶降解酶活性，底物为κ-卡拉胶，于500 nm处测定吸光度。

以卡拉胶降解酶粗酶液(发酵液)水解κ-卡拉胶得到1 mg还原糖所需的酶量为1个酶活单位(U)。

1.4 菌株的鉴定

设计16S rDNA的通用引物，以菌株S942的DNA全长为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：97 ℃，1 min；52 ℃，1.5 min；75 ℃，1 min；循环32次，延伸温度为75 ℃，时间为10 min。提取纯化后的样品送上海鼎安生物科技有限公司测序。将菌株S942的16S rDNA序列同GenBank数据库进行BLAST分析，并选取若干亲缘关系较近的细菌DNA序列，采用BioEdit软件、MEGA 6.06软件的邻接法建立系统发育树[14]。

1.5 菌株产酶条件的优化

采用单因素法分别研究初始pH值、培养温度、碳源、氮源、金属离子、接种量及摇床转速对菌株S942产酶的影响，以确定该菌株产酶的最适条件。

1.5.1 初始pH值对菌株S942产酶的影响

将适量菌株S942接种于初始pH值分别为 4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0的发酵培养基(250 mL锥形瓶中加入100 mL培养液，下同)中，在10 ℃培养箱中摇床培养24 h，测定发酵液中卡拉胶降解酶活性。

1.5.2 培养温度对菌株S942产酶的影响

将适量菌株S942接种于发酵培养基中，分别在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃的培养箱中摇床培养24 h，测定发酵液中卡拉胶降解酶活性。

1.5.3 碳源对菌株S942产酶的影响

将适量菌株S942接种于发酵培养基中，发酵培养基中分别添加葡萄糖、乙酸钠、0.2%卡拉胶、蔗糖、淀粉作为碳源，于培养箱中摇床培养24 h，测定发酵液中卡拉胶降解酶活性。

1.5.4 氮源对菌株S942产酶的影响

将适量菌株S942接种于发酵培养基中，发酵培养基中分别添加蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、牛肉膏、硝酸铵、硝酸钠作为氮源，于培养箱中摇床培养24 h，测定发酵液中卡拉胶降解酶活性。

1.5.5 金属离子对菌株S942产酶的影响

将适量菌株S942接种于发酵培养基中，发酵培养基中分别加入金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、K+、Na+、Zn2+，于培养箱中摇床培养24 h，测定发酵液中卡拉胶降解酶活性。

经费是把“双刃剑”，用好可以激励人，用不好就会妨碍事件的发展。用好可以成事，用不好就会坏事。农村小学校经费少，所以学校管理者要发挥集体智慧，做好预算和统筹，把有限的经费用好用活。

分别以接种量1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%将菌株S942接种于发酵培养基中，于培养箱中摇床培养24 h，测定发酵液中卡拉胶降解酶活性。

Engineering geological characteristics and formation mechanism of Baozhu landslide in

将适量菌株S942接种于发酵培养基中，于培养箱中分别以50 r·min-1、100 r·min-1、150 r·min-1、200 r·min-1的转速摇床培养24 h，测定发酵液中卡拉胶降解酶活性。

1.6 酶学性质初步研究

1.6.1 反应温度对卡拉胶降解酶活性的影响

为提高船舶数据的存储容量和安全性，该数据网络平台建立有分布式数据库，船舶各系统数据被采集之后经数据传输网络存储到各存储节点，进行合理的数据备份和数据预处理。为提高数据的利用效率，对各存储节点进行原始数据的合理保留及对预处理后的数据进行分层，在基础应用层存储基础应用(如机舱设备故障检测等)数据模型所需的数据，在高级应用层存储高级应用(如船舶调度等)数据模型所需的数据。

取于37 ℃培养箱中摇床培养24 h的发酵液，低温离心后得到卡拉胶降解酶粗酶液，分别在反应温度 20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下进行酶催化反应，60 min后采用DNS法测定酶活，确定该酶催化反应的最适反应温度。

2.3.6 接种量对菌株S942产酶的影响(图7)

取于37 ℃培养箱中摇床培养24 h的发酵液，低温离心后得到卡拉胶降解酶粗酶液，分别在 pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0下进行酶催化反应，60 min后采用DNS法测定酶活，确定该酶催化反应的最适反应pH值。

1.5.6 接种量对菌株S942产酶的影响

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选结果

在筛选固体培养基上进行卢戈氏碘液染色，肉眼观察到：菌落周围出现明显透明圈，呈圆形，边缘光滑、湿润。采用DNS法测定单菌发酵液的酶活性，经比较，菌株S942产卡拉胶降解酶活性最高。

2.2 菌株S942分子生物学鉴定结果

菌株S942测序后得到长度为1 334 bp的16S rDNA序列，将此序列与 GenBank数据库进行BLAST比较。结果表明，与菌株S942同源性较高的菌株均为假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas sp.)，且其同源性都大于99%。菌株S942的系统发育树见图1。

  

图1 菌株S942的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of strain S942

2.3 菌株S942产酶条件的优化

由图4可知，0.2%卡拉胶作为唯一碳源时，菌株S942产卡拉胶降解酶的相对酶活最高，最适宜菌株S942生长，其酶活达到9.724 U·mL-1，其次为蔗糖、乙酸钠、葡萄糖，淀粉最低。表明，菌株S942对碳源具有一定的底物特异性。

由图2可知，随着初始pH值的升高，菌株S942产卡拉胶降解酶的相对酶活先升高后降低，当初始pH 值为7.0时，卡拉胶降解酶的相对酶活最高，酶活为8.704 U·mL-1。因此，确定菌株S942产酶的最适初始pH值为7.0。

1.5.7 摇床转速对菌株S942产酶的影响

③溃坝坝型主要为土石坝，为坝型明确案例的75.2%；坝型信息欠缺的约占19.3%，根据破坏信息判断大多也为土石坝；其他坝型主要为堆石坝、拱坝、砌石坝、条石坝等，仅占溃坝总数的5.6%。

绝大多数的产卡拉胶降解酶菌株培养的最适pH值在7.0～8.0[7-10]之间，菌株S942亦在此范围内。

菌株，分离于南极地区的海水和海冰样品中的藻类。

2.3.2 培养温度对菌株S942产酶的影响(图3)

  

图2 初始pH值对菌株S942产酶的影响Fig.2 Effect of initial pH value on enzyme-producing of strain S942

  

图3 培养温度对菌株S942产酶的影响Fig.3 Effect of culture temperature on enzyme-producing of strain S942

培养温度的变化会影响菌株生长情况，继而影响其产酶活力。由图3可知，培养温度为37 ℃时，菌株S942产卡拉胶降解酶的相对酶活最高，酶活为9.110 U·mL-1；培养温度过高，菌株S942产卡拉胶降解酶的相对酶活下降较快。因此，确定菌株S942产酶的最适培养温度为37 ℃ 。

本文运用Abaqus有限元软件建立了施工段三维计算模型，并对盾构施工过程进行精细化仿真模拟。模拟中，假定工程条件及仿真方法如下：

不同菌株产卡拉胶降解酶最适培养温度有所不同，Yao 等[15]分离的菌株为 35 ℃；Li等[16]分离的菌株为45 ℃；Liu 等[17]分离的菌株为 55 ℃。菌株S942产卡拉胶降解酶的最适培养温度较低。

2.3.3 碳源对菌株S942产酶的影响(图4)

  

图4 碳源对菌株S942产酶的影响Fig.4 Effect of carbon source on enzyme-producing of strain S942

2.3.1 初始pH值对菌株S942产酶的影响(图2)

The three arrive at a marine life institute（海洋生物研究所）first.Here they meet Hank.Hank becomes their guide（向导）.But the trip is not always a bed of roses（一帆风顺）.

2.3.4 氮源对菌株S942产酶的影响(图5)

根轨迹法是分析和设计线性控制系统的图解方法。根轨迹不仅可以指出系统某一参数变化时所有的闭环极点在S平面上的位置和动态性能，而且可以指明开环零极点的变化对系统的影响。

由图5可知，硫酸铵作为氮源时，菌株S942产卡拉胶降解酶的相对酶活最高，酶活为4.371 U·mL-1，其次为硝酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硝酸钠。因此，确定菌株S942产酶的最适氮源为硫酸铵。

  

图5 氮源对菌株S942产酶的影响Fig.5 Effect of nitrogen source on enzyme-producing of strain S942

2.3.5 金属离子对菌株S942产酶的影响(图6)

  

图6 金属离子对菌株S942产酶的影响Fig.6 Effect of metal ion on enzyme-producing of strain S942

由图6可知，金属离子对菌株S942产卡拉胶降解酶有较大影响，Ca2+、Mg2+、Na+对菌株产酶有促进作用，其中Ca2+最佳；Mn2+、Cu2+、K+、Zn2+对菌株产酶有抑制作用，其中K+抑制作用最强。金属离子不仅对菌株的生长有影响，而且能够改变酶的构象，从而改变酶活性[18]。Liu等[17]研究发现，Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+抑制酶活，Mg2+、Ba2+能够促进酶活。马悦欣[18]研究发现，Zn2+、Cu2+、Mn2+能够抑制酶活，但Ba2+、Mg2+、Ca2+对酶活的影响不大。表明，不同的金属离子对菌株酶活的影响不同，同一种金属离子对不同的菌株酶活的影响也不同。确定菌株S942产酶添加Ca2+。

1.6.2 反应pH值对卡拉胶降解酶活性的影响

由图7可知，随着接种量的增加，菌株S942产卡拉胶降解酶的相对酶活先升高后降低，接种量为5%时，卡拉胶降解酶的相对酶活最高。接种量过高或者过低都不利于菌株产酶，在培养时间相同时，接种量过低，菌株S942数量不多，使得产酶量不高；接种量过高，会由于竞争力过大而不利于菌株生长，影响菌株产酶。因此，确定菌株S942产酶的最适接种量为5%。

  

图7 接种量对菌株S942产酶的影响Fig.7 Effect of inoculation amount on enzyme-producing of strain S942

2.3.7 摇床转速对菌株S942产酶的影响(图8)

  

图8 摇床转速对菌株S942产酶的影响Fig.8 Effect of shaking speed on enzyme-producing of strain S942

由图8可知，当摇床转速低于150 r·min-1时，随着摇床转速的加快，菌株S942产卡拉胶降解酶的相对酶活升高，而当摇床转速提高到200 r·min-1时，相对酶活下降。这可能是由于，摇床转速加快，增大了摇瓶内的溶氧量，有利于菌株S942对营养物质的利用，从而促进菌株产酶；而过高的摇床转速不利于菌株S942生长。因此，确定菌株S942产卡拉胶降解酶的最适摇床转速为150 r·min-1。

2.4 酶学性质初步研究

2.4.1 最适反应温度(图9)

(5)千年古村民居.华堂村的古民居均为四面房子、中间天井的四合院形式，有颇具特色的卵石路相通，均有百余年历史.不少古民居因住户外出打工、另建新房等原因，已没有人居住，也没有人维修、开发利用.调查中走访的一处华堂村内最大最有名的古民居“善庆堂”，整个建筑群只有一个80多岁的老人居住.据调查统计，华堂村有一半以上的古民居处于无人居住的闲置状态.

  

图9 反应温度对卡拉胶降解酶活性的影响Fig.9 Effect of reaction temperature on carrageenase activity

由图9可知，反应温度为30～40 ℃时，卡拉胶降解酶具有较高的活性，反应条件较为温和；当反应温度为37 ℃时，卡拉胶降解酶的相对酶活最高。因此，确定卡拉胶降解酶的最适反应温度为37 ℃。

2.4.2 最适反应pH值(图10)

  

图10 反应pH值对卡拉胶酶活性的影响Fig.10 Effect of reaction pH value on carrageenase activity

由图10可知，反应pH值为7.0时，卡拉胶降解酶的相对酶活最高，因此，确定卡拉胶降解酶的最适反应pH值为7.0左右。过酸过碱均会抑制酶活，这是因为强酸强碱会使蛋白质变性失活。卡拉胶降解酶的最适反应pH值为中性，易于应用时的调控。

3 结论

从6种南极海藻中筛选分离出1株高产卡拉胶降解酶的菌株S942，菌株S942与Pseudoalteromonas内的多个菌株的16S rDNA相似度较高(均大于99%)，鉴定菌株S942属于假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas sp．)；该菌株在初始pH值为7.0、培养温度为37 ℃、碳源为0.2%卡拉胶、氮源为硫酸铵、添加Ca2+、接种量为5%、摇床转速为150 r·min-1的条件下发酵培养24 h时产酶量最高；所产卡拉胶降解酶的酶催化反应最适反应温度为37 ℃、最适反应pH值为7.0。

（2）内部流程方面：部门承担创新任务程度实际值通过年末对各部门所完成的任务数汇总得出，各部门未完成的任务数不得计入该项目。得分=（完成数/目标数）×权重；创新人才数量实际值通过年末对企业实施高层次人才引进战略所拥有的专业高级职称和硕士研究生以上学历人员数汇总得出，得分=（实际数量/去年已有数量）×权重；企业各种大小会议的召开或多或少都与实施创新绩效管理战略相关。因此，集体讨论学习有关创新工作的会议次数实际值为全年会议召开总时间。得分=实际数量×权重×40%；技术创新中所申请的专利数实际值由汇总企业年末申请的专利数得出。得分=实际值×权重×60%。

菌株S942产酶条件温和，碳源和氮源价廉易得，所得卡拉胶降解酶反应条件温和易控，酶活力高，因而菌株S942有着良好的应用前景。因菌株S942为自然界分离出来的野生菌，其发酵产卡拉胶降解酶存在产酶复杂、不易分离纯化、产酶条件不稳定且产量低等缺点。在今后的研究中，可通过基因工程手段来提高野生菌Pseudoalteromonas sp．S942产κ-卡拉胶降解酶的活力以及实现大量生产并降低成本，为该菌株在工业化生产中的开发利用奠定基础。

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