中国大鲵皮肤分泌物的研究现状

中国大鲵(Andrias davidianus)俗称娃娃鱼，属两栖类,有尾目,隐鳃鲵科，为我国特有的大型珍稀两栖动物，广泛分布于陕西、江西、四川、湖南、湖北等17个省。大鲵的肌肉、皮肤、器官、骨骼等都可以入药，经常食用大鲵具有延缓衰老、聪明益智、促进造血和增强免疫功能的作用，有助于防治恶性贫血、心脑血管系统疾病和恶性肿瘤[1-2]。大鲵的皮肤不仅对其呼吸具有极大影响，在应对外界环境变化的防御机制中也存在不可或缺的作用。大鲵皮肤的真皮层存在黏液腺和颗粒腺这两种多细胞腺体。黏液腺体细胞可释放黏滑的分泌物，与水结合后成为黏液，覆盖在上皮游离面，形成一道天然的防护屏障，具有防御、保湿、促进皮肤呼吸等作用[3]；而颗粒腺能够分泌具有特殊性气味的白色黏稠状黏液，其成分是功能多样的生物活性分子[4]。随着大鲵养殖规模的发展，如何对大鲵进行进一步的深加工，成为该养殖业是否还能持续发展需要解决的一大难题。目前对于中国大鲵的研究利用，多是处死后进行，这对其资源的保护和繁殖极为不利。而大鲵皮肤表面广布腺体，可采用非损伤性取样方法收集体表分泌物，进行开发研究。这样既不影响大鲵本身的生长繁殖，还能达到这一资源的最大限度利用。

1 大鲵皮肤分泌物中营养成分

大鲵皮肤分泌物的取样均采用非损伤性取样方法，即通过机械刺激或电刺激促使大鲵皮肤分泌黏液，真空冷冻干燥成冻干粉后保存，以供继续研究。大鲵皮肤分泌物中的营养物质主要为蛋白质和多糖类物质，其氨基酸组成较为全面，包含谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸以及人体必需氨基酸等17种氨基酸，总量丰富[5]，苏氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺和谷氨酸/谷氨酰胺的含量较高[6]，可以作为优质食物蛋白的来源。2014年，陈德经等人对分泌物进行了单糖组分分析，利用不同提取方法进行了粗提实验，最后发现碱提取所得多糖率最高，单糖种类也最多，主要由甘露糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖3种单糖组分组成[7]。针对大鲵皮肤分泌物营养物质的研究主要涉及以上几种成分，还有研究发现分泌物中还含有少量脂肪[8]，而维生素以及无机盐含量未见具体记录。

2 大鲵皮肤分泌物药理活性

大鲵皮肤颗粒腺能够分泌具有特殊气味的白色黏稠状黏液，并含有功能复杂多样的生物活性分子，可作为天然药用资源进行开发利用。其药理活性成分主要由糖类和蛋白质多肽组成，以糖蛋白、低聚糖肽等复合物和多肽的形式存在并发挥其生理活性。

大鲵皮肤分泌物中含有广谱高效、不易产生耐药性的抗菌活性物质，使得其不容易被细菌、真菌等微生物所侵染，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均具有抵抗作用。Qu等采用SDS - PAGE、HPLC和质谱分析法从大鲵皮肤分泌物获得由两个相同的8.5 kDa亚基组成的凝集素，并了解到连接这两个亚基的结构为二硫键，进一步研究发现该物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用与青霉素相差不大[9]。在此之前，Qu等还利用海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解大鲵皮肤分泌物，得到了分子量小于3 500 Da，具有O-连接糖肽键结构的大鲵低聚活性糖肽。该糖肽可显著增加实验小鼠血清IgG和巨噬细胞数量，提高T淋巴细胞活性，这也证明了大鲵皮肤分泌物具有增强小鼠免疫功能的作用[10-11]。王利锋等人利用5%乙酸浸提、SephadexG-50/25凝胶过滤层析，从分泌物中获得了一种分子量为4 300 Da，表现强阳离子特性的抗菌肽，对铜绿假单胞菌具有较强抗感染作用，且效果与磺胺米隆无明显差异[12-13]。但是也存在一些研究结果与上述不一致，可能是因为提取浓度达不到抑菌浓度；或是由于提纯条件控制不当，使其结构改变，活性改变，因此可借鉴提取两栖类抗菌肽多采用的酸提法，因为酸性溶液易进入组织细胞，且抗菌肽多为碱性蛋白，在酸性条件下溶解度高，酸性条件还可抑制组织中影响抗菌肽活性的内源性蛋白酶的活性[14]。

仪器的流量分为工况流量和刻度流量，工况流量即设备在使用环境下的实际流量，刻度流量，即标准状态下的流量，有些仪器的刻度状态是(0 ℃，101.325kPa)，有些设备的刻度状态为(20 ℃，101.325kPa)，也有些其他特殊的状态，具体以被检设备为准。在测量重复性和稳定性时我们要读取的数值为检定点的工况流量，但在测量示值误差时我们则需要读取刻度状态下的流量。采样器的流量计上有些显示的是工况流量，有些显示的是刻度状态下的流量，如果为工况流量，像安装浮子流量计的采样器，这时我们必须对流量示值加以换算，在气路压力为0kPa情况下测量的流量，具体过程按公式(1)进行计算。

大鲵皮肤分泌物在防治疾病方面也具有一定作用。首先，在危害人类健康的三大杀手之一癌症的研究中，徐伟良等人利用MTT比色法，发现所提纯的糖蛋白样品对人乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞A 549的增殖均具有抑制作用[4, 19]，只是目前针对大鲵皮肤分泌物对癌症发生发展的影响机制还没有进一步的研究结果。其次，心血管疾病同癌症一样，是危害人类健康的重大疾病，有研究发现，大鲵皮肤分泌物具有良好的抗血小板凝集活性，与阿司匹林的作用相当，并对血管紧张素转换酶(ACE)具有较好的抑制活性，因此还可将其作为抗血栓及抗高血压药物进行深入研究[20-21]。最后，在利用小鼠建立相关疾病模型的研究中发现，大鲵低聚糖肽可显著抑制四氯化碳(CCl4)造成的血清中谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)活性的升高，降低肝脏组织丙二醛(MDA)含量，使肝组织损伤明显减轻，具有护肝作用；在烫伤、冻伤治疗方面，大鲵低聚糖肽可促进损伤组织修复，降低炎症反应程度[22-24]。

大鲵皮肤分泌物具有调节生理代谢的功能，可产生抗氧化和抗疲劳的药理作用。科学研究发现，癌症，衰老等都与机体内过量的自由基有关，而抗氧化能力可帮助机体抵抗这些自由基的伤害。大鲵皮肤分泌物中含有可清除氧化自由基的有效成分，具有较好的抗氧化活性。曲敏和金桥等的研究结果都证明了提纯的活性物质具有高效清除DPPH自由基，羟基自由基及超氧阴离子自由基的作用[15-16]。刘豪等还将对上述自由基的清除率与VC、VE作比较，发现其抗氧化性能虽不如VC，但与VE相差不大，且对DPPH自由基的清除率高于VE[8]。为了探究不同育龄大鲵皮肤分泌物中低聚糖肽的抗氧化能力，王茁利用3育龄和6育龄大鲵进行了实验，结果表明，6育龄大鲵的低聚糖肽抗氧化性能强于3育龄，原因可能是6育龄的大鲵处于繁殖期，身体各项指标都已达到较优状态[17]。抗氧化能力的发挥还可能延缓运动性疲劳发生和加快体能恢复，故又有研究者在利用小鼠负重游泳测其疲劳度的时候发现，灌服大鲵低聚糖肽的小鼠，肝糖原消耗量和肌肉中乳酸含量都较低，同时游泳时间还显著增加，证明了大鲵皮肤分泌物具有抗疲劳作用[18]。

烟气经过湿法脱硫后，由于高温烟气与碱性脱硫剂直接接触，高温烟气被增湿降温，碱性脱硫剂溶液中的部分水分吸热汽化，最终烟气达到饱和状态。饱和烟气从烟囱排出，与温度较低的大气混合后降温，饱和混合烟气的含湿量降低，大量水蒸汽就结露析出，形成了白雾现象。

大鲵皮肤分泌物还具有一定护肤作用。除已提到的抗氧化功能外，大鲵皮肤分泌物被进一步证实具有吸湿保湿，抗紫外线损伤的功能，可淡化色斑，修复皮肤，延缓皮肤衰老。在将其制备成面膜和润肤膏进行人体试用后发现，受试者未出现不良反应，在使用面膜后，VISIA皮肤图像分析系统结果显示，皱纹、紫外线色素斑及棕色斑明显改善，且受试者经过此项治疗后，自觉皮肤状态得到了改善[25-26]。

⑯ ㉖ ㉘ ㉙ J．Ziekow ，Verankerung verwaltungsrechtlicher Kooperationsverhaltnise(Public Private Partnership)im Verwaltungsverfahrensgesetz，2001，S．391．

3 大鲵皮肤分泌物基因

目前，相对于其他两栖动物，特别是蛙类来说，大鲵皮肤分泌物在基因方面的研究还较少。GUO等将提取到的分泌物采用Chelex法和12S rRNA基因序列进行扩增和测序，交叉比对发现得到的基因序列跟从肝脏中得到的序列是相同的，说明可采用非破坏性的方法来进行中国大鲵遗传学方面的研究[27]。2017年，Yang等人成功得到了大鲵的第一个抗菌肽基因，与其他同源基因一样，都具有一段相同的保守区域。其ORF序列由447 bp组成，编码含148个氨基酸的多肽，包括一个由20个氨基酸残基构成的信号肽，一个由94个氨基酸残基构成的cathelin结构域，以及一个由34个氨基酸残基构成的与其他物种完全不同的成熟肽。半定量PCR显示其只在皮肤有表达，实时荧光定量PCR也显示在皮肤中高度表达。这主要是因为皮肤作为大鲵防御外界危害的第一道防线，为抵抗病原微生物的侵袭，必将分泌大量抗菌活性因子，这也揭示了其在先天免疫反应中的重要作用[28]。

4 展望

两栖动物皮肤对其维持自身生存和适应多样化的生态环境具有不可或缺的作用，可帮助其进行呼吸作用，保持水分，抵抗病原微生物侵袭及天敌捕食等。它们皮肤腺体所分泌的物质，是发挥以上作用的主要来源。故多年来，两栖类动物皮肤分泌物一直是研究热点，并已经有部分研究成果进入到了临床试验阶段，特别是蛙皮素与抗菌肽。在哺乳动物中也存在相似功能物质的蛙皮素，对免疫、神经、消化系统都具有广泛的作用，目前的研究主要涉及抑制其受体作用，从而达到治疗肿瘤的目的方面[29]。抗菌肽的研究成果是已经将蛙科动物皮肤抗菌肽分为若干个抗菌肽家族，对其作用机制也有了初步研究，可能是通过形成“膜通道”使胞内物质外溢，及其“选择性杀伤”机制来实现抗菌作用[30-31]。相对于蛙科动物的研究，同样作为两栖动物的大鲵，其皮肤分泌物还存在很多未解之谜，例如当中具有一定生理功能的成分具体是什么，它们的作用机制是什么，如何有效提纯这些成分，还不甚清楚。与此同时，大鲵皮肤分泌物具有一定臭味，粗提物急毒性的试验结果也表明其具有低毒性，经分析检测后发现其成分分别为8种氨基酸和二甲基二硫醚，可经乙醇脱毒和酶解后开发利用[32-33]，但也有研究发现其粗提物在100 ℃下水浴10 min后也可脱毒[34]。所以大鲵皮肤分泌物中存在的毒性成分是什么，如何保证安全利用，还需要继续研究。只有将限制开发的难题逐渐攻克，才能保证更好地利用大鲵这一生物资源。

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Abstract：Chinese giant salamander(Andrias davidianus) is a unique amphibian species in China, and the current research on Chinese giant salamander is mainly about biological evolution, biodiversity, and the molecular mechanisms of gender deter mination. However, with the rise of the study of amphibian skin secretion, people gradually found that the skin of Chinese giant salamander can secrete large amounts of active substances, which have good medicinal and nutritional value. In order to provide valuable reference for researchers, we collated and reviewed the researches of Chinese giant salamander skin secretion , which involved nutritional composition, pharmacological activity and gene, and looked forward to its future research.

Key words：Chinese giant salamander(Andrias davidianus); skin secretion; nutritional composition; pharmacologically activity; gene