平贝母总生物碱提取工艺优化研究*

平贝母是《中国药典》2015年版一部收载药材，为百合科贝母属多年生草本植物平贝母Fritillaria ussuriensis Maxim.的干燥鳞茎[1]，具有止咳平喘、润肺化痰的作用[2]，是最重要的止咳祛痰药之一[3]。平贝母中含有多种活性成分，如生物碱类、生物碱苷、腺苷类及多糖类等成分，其中生物碱类是其主要的生物活性成分[4，5]。本文采用酸性染料比色法测定平贝母中总生物碱含量，考察加热回流、超声及冷浸提取对总生物碱提取率的影响，以及对氨水用量和浸润时间的优化，筛选出最佳条件，为单体生物碱的研究测定提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器及药品

722E型计紫外可见分光光度（上海光谱仪器有限公司）；KQ-300E超声波清洗器（型昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；101-1AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；TD10001A型电子天平（天津市天马仪器厂）。

贝母素乙对照品（纯度≥98%，上海源叶生物有限公司）；氯仿、甲醇等试剂均为分析纯。

平贝母采自黑龙江省伊春市红星区试验基地。以清水洗净须根及泥土，沥去水滴，置于45℃鼓风机中烘干。彻底干后，将其粉碎成均匀粉末放置于干燥器中，备用。

扑火队实行半专业化管理，保证队伍人员相对稳定，平时要自觉遵纪守法常备常练。在森林防火期(每年9月15日至次年4月30日)，队员必须整装待命；森林高火险预警期，实行24h值班和领导带班制度，严格执行火警火灾零报告制度，确保信息畅通。明确要求所有扑火队伍人员在禁火期值班期间不得随意请假，切实有急事需请假者，由当班人员找人替岗，并经带班领导审批方可请假。接到扑火指令后，队员应积极配合，半小时内集合完毕，自行携带扑火机具等装备，赶往火场，积极参战，做到火灾全部扑灭，接到撤退指令后方可撤离。扑火队员在国有林场出现火情时归场森林防火指挥部办公室统一指挥下运作。

1.2 标准曲线的制备

精密吸取贝母素乙对照品1.98mg，置于20mL量瓶中，加CHCl3溶解并稀释至刻度，即得对照品溶液。精密量取对照品溶液 0.5、1、2、3、4、5mL，分别置25mL量瓶中，精密加入0.2mol·mL-1邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液（取0.2mol·mL-1邻苯二甲酸氢钾溶液100mL，用0.2mol·mL-1 NaOH溶液约50mL调节pH值为5.0，即得）5mL，再精密加0.03%溴百里香酚蓝试液（取溴百里香酚蓝0.03g，用lmol·L-1 NaOH溶液0.5mL使溶解，加水稀释至100mL，即得）2mL，加CHCl3至刻度，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置45min。取CHCl3液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401）在412nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得到吸光度Y与总生物碱含量X（mg·mL-1）之间的回归方程：

2.1.2 加样回收率 精密吸取已知含量的供试液5份，分别加入贝母素乙对照品溶液，测定吸光度，计算回收率。结果表明，平均回收率为98.86%，说明本方法准确可靠。

  

图1 贝母素乙标准曲线Fig.1 Standard curve of Peiminine

1.3 回流提取

取本品粉末（过60目筛）2g，精密称定，置圆底烧瓶中，A：精密加入浓氨试液3mL，静置，浸润1h；B：精密加入浓氨试液3mL，静置，浸润2h；C：精密加入浓氨试液3mL，静置，浸润3h；D：精密加入浓氨试液4mL，静置，浸润1h；E：精密加入浓氨试液4mL，静置，浸润2h；F：精密加入浓氨试液4mL，静置，浸润3h；G：精密加入浓氨试液5mL，静置，浸润1h；H：精密加入浓氨试液5mL，静置，浸润2h；I：精密加入浓氨试液5mL，静置，浸润3h。精密加CHCl3-甲醇（4：1）的混合溶液40 mL，置80℃水浴加热回流2h，放冷，滤过，用适量CHCl3-甲醇（4∶1）混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液与滤液合并，蒸干，残渣加CHCl3使溶解，转移至25mL量瓶中，加CHCl3至刻度，摇匀，即得。

国内高校创新创业教育主要分为以下几类:结合通识教育开展的创新创业基础公共课程;结合专业教育开展的某领域创新创业选修课程;在大学生就业指导课程中融入的创新创业章节;邀请专家来校做创新创业讲座;团委、就业指导中心旗下的创新创业指导培训班;各种科研创新基金立项，等等。创新创业教育实现了从无到有的突破，创新创业的意识得到提高，创新创业的资源增加，大学生创新创业的热情高涨。在政策鼓励下，各大企业也瞄准高校科研创新风口，加快企校合作，建立产学研基地，为高校创新创业教育创造条件。

1.4 超声提取

取本品粉末（过60目筛）2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入浓氨试液3mL，静置，浸润2h，精密加CHCl3-甲醇（4∶1）的混合溶液40 mL，混匀，A：超声处理 25min，静置 15h；B：超声处理 25min，静置 25min，再超声处理 30min；C：超声处理 25min，静置 25min，再超声处理 1h；D：超声处理 25min，静置25min，再超声处理2h；E：超声处理25min，静置25min，再超声处理3h；F：超声处理25min，静置25min，再超声处理4h；G：恒温50℃，超声处理25min，静置 25min，在再超声处理 30min；H：恒温50℃，超声处理25min，静置25min，在再超声处理45min；I：恒温 50℃，超声处理 25min，静置 25min，在再超声处理60min。滤过，用适量CHCl3-甲醇（4∶1）混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液与滤液合并，蒸干，残渣加CHCl3使溶解，转移至25mL量瓶中，加CHCl3至刻度，摇匀，即得。

精密量取供试品溶液2mL，至25mL量瓶中。精密加入0.2mol·L-1邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液5mL，再精密加入0.03%溴百里香酚蓝试液2mL，加CHCl3至刻度，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置45min。取CHCl3液，用干燥滤纸滤过，取续滤液。

1.5 冷浸提取

2.1.1 精密度、重复性和稳定性 取同一贝母素乙对照品溶液，测定吸光度，连续测定6次，其RSD值为1.16%；取供试样品溶液1份，重复测定6次，其RSD值为1.22%；取样品溶液，分别于放置至0、2、4、6、8、12h 测定吸光度，其 RSD值为 1.63%。表明供试样品溶液在12h内稳定性较好，精密度及重复性均符合要求。

1.6 测定

结合表3不同植被恢复模式AWCD的方差分析表明，刺槐+山杏+紫花苜蓿(0.94±0.44)和油松+旱柳+红豆草混交林(0.65±0.38)土壤微生物利用碳源的量显著高于自然恢复（P<0.01），而青海云杉+油松+河北杨和刺槐+油松混交模式下土壤微生物利用碳源的量显著低于自然恢复（P<0.01），即刺槐+山杏+紫花苜蓿混交林土壤微生物代谢活性最强，而刺槐+油松(0.45±0.32)和青海云杉+油松+河北杨混交林(0.26±0.18)相对于自然恢复土壤微生物代谢活性相对较弱。

考察NH3·H2O用量、NH3·H2O浸润时间对加热回流提取总生物碱的影响，NH3·H2O用量设为3、4、5mL，浸润时间设为1、2、3h，共设置了9个不同处理组。实验结果见图2。

以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401）在412nm波长处测定吸光度，代入线性回归方程计算溶液浓度。重复测定3次，即得。

改革开放40年，中国经济走在了再一次转型升级的新起点上。国家统计局数据显示，自2012年起，服务业开始超过工业成为中国国民经济的第一大产业；截至2017年，服务业的产业增加值在国内生产总值中占比达到51.6%，超过农业和工业的总和。这意味着，中国市场已然开始从产品时代向用户时代全面过渡，从产品导向向需求导向转变。影响消费者的消费因素也开始从“经济实用”向“品牌价值”转化，品牌开始成为主导产品价值判断的重要符号。

传统数学描述工具(如集合论[13]、图论[14]等)在对类似的层次模型进行形式化描述时，不仅要对模型中的每一个元素建立集合，还要对关联元素单独建立集合或关系图，既繁琐又不够清晰，同时缺乏严格的逻辑推理操作方法。多色集[15]的特点是能够描述集合本身及其组成元素的性质,以及集合本身性质与其组成元素及性质之间的相互关系。下面基于多色集理论将图4中模型元素间的关系进行直观表达。

式中 W：总生物碱含量，%；C：溶液浓度，mg·mL-1；F：溶液稀释倍数；V：溶液体积，mL；m：样品质量，mg。

2 结果与讨论

2.1 平贝母总生物碱含量测定方法学考察

取本品粉末（过4号筛）2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓氨试液3mL，静置，浸润2h，精密加CHCl3-甲醇（4∶1）的混合溶液40 mL，密闭，放置20h后，滤过，用适量CHCl3-甲醇（4∶1）混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液与滤液合并，蒸干，残渣加CHCl3使溶解，转移至25mL量瓶中，加CHCl3至刻度，摇匀，即得。

Y=41.03X+0.0972，R2值为 0.9984，在 0.0020～0.0198mg·mL-1范围内有良好的线性关系。

2.2 加热回流提取工艺

取待测样品溶液，选定波长412nm处测定吸光度（相应溶剂为参比溶液），代入回归方程中求平贝母总生物碱含量（质量浓度），计算平贝母总生物碱的得率：W=（C×F×V）/m×100%。

  

图2 不同回流提取条件对生物碱得率的影响Fig.2 Effects of different reflux extraction conditions on the yield of alkaloids

从图 2 可知，NH3·H2O用量 3mL，浸润 2h，提取效果最佳，总生物碱的提取率最高，达0.1910%。其次是NH3·H2O 3mL，浸润1h，生物碱百分含量为0.1872%。总体来看，在NH3·H2O用量为3、4、5mL范围内，总生物碱提取率随NH3·H2O用量的增加而降低，且在浸润时间为1、2、3h范围内，总生物碱提取率与浸润时间未成正比，NH3·H2O用量为5mL，浸润3h总生物碱提取率最差，仅为0.1330%，其原因可能是氨水用量太多，浸润时间太长，使得平贝母内其他成分被提取出来，导致总生物碱得率降低。

2.3 超声提取工艺

本文采用了三类超声方法，考察不同超声条件对总生物碱提取率的影响，共设置了9个不同处理组。通常采用超声25min静置过夜，计算平贝母总生物碱提取率。但考虑到时间问题，将超声-静置处理更改为两次超声处理，比较生物碱提取率，发现两次超声处理比通常采用的超声方法对生物碱提取率更高，且更为省时。由于超声时水温会自动升高，故超声处理均采用流动的活水，保持温度在10℃。在此基础上，保持温度为50℃，再超声处理，即回流与超声结合，比较总生物碱得率。结果表明，50℃恒温超声25min，再超声45min，提取率最高，达0.2323%，其次是50℃恒温超声25min再超声60min，其与超声25min再超声120min对总生物碱的提取率相近，分别为0.2279%和0.2246%，说明一定范围内的温度可提高生物碱提取率。

  

图3 不同超声提取条件对生物碱得率的影响Fig.3 Effects of different ultrasonic extraction conditions on the yield of alkaloids

2.4 冷浸法提取

采用冷浸法提取平贝母中的总生物碱成分，3次测得的平均吸光度值为0.511，带入回归方程计算总生物碱得率为0.1576%。

2.5 比较不同提取工艺

由所得数值可知，冷浸提取法对提取率最差，且总生物碱提取率相对较低，不如回流提取和超声提取。而三者中，恒温50℃超声25min，再超声45min，总生物碱提取率最高。原因可能是在超声的基础上受热温度变高，可使提取溶剂与样品反应更加完全，可在短时间内得到最佳提取率，省时又省力。回流提取中氨水的用量和浸润时间是本文主要考察的两个因素，通过实验发现氨水3mL浸润2h提取率最佳，且总生物碱得率不随氨水用量和浸润时间的增加而提高。

3 结论

本文对平贝母中总生物碱成分的提取工艺做了优化，分别采用了回流提取法、超声提取法和冷浸提取法，为后面单体生物碱的测定奠定了坚实的基础。实验得出，恒温50℃超声25min，静置25min，再超声45min，对平贝母总生物碱的提取率最高。加热回流提取法对平贝母总生物碱的提取率较超声提取法低，不稳定，条件不易控制；超声提取法费时；冷浸提取法不仅费时，得率也较低。故本文采用了回流与超声相结合的提取工艺，超声的最高温度是50℃，之后不会再随时间的增加而升高，温度保持在50℃恒定，此时的温度会使样品溶液反应的更加完全，挥发出的气体会在冷凝管的作用下回流，保证了样品及溶剂的零损失。实验结果证明，回流提取法与超声提取法结合更有利于平贝母总生物碱的提取，不仅提取时间短、得率高，且重现性好，为今后研究贝母类药材提取工艺提供有力依据。

首选观点是12月19日和12月20日的时间节点开始为期两三个交易日的反抽运行，大约运行到12月24日结束，随后市场继续向下运行，于2019年元旦前后一个交易日结束下跌回落；

参考文献

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：97.

［2］ 吴晓民，王艳红，郑友兰.HPLC测定不同产地平贝母中贝母甲素的含量［J］.中国药学杂志，2006，（20）：1535-1537.

［3］ Li S，Lin G，Chan S，et al.Determination of the Major Isosteroidal Alkaloids in Bulbs of Fritillaria By High-performance Liquid Chromatography Coupled with Evaporative Light Scattering Detection［J］.JChromatogr a，2001，909（2）：14-207.

［4］ 韩静，丁永辉，宋平顺.HPLC-ELSD法同时测定平贝母中贝母素甲、贝母素乙的含量［J］.中国药师，2009，12（5）：595-597.

［5］ 张舒娜，张浩，马琳，等.近红外光谱法测定平贝母中总生物碱含量［J］.医药导报，2016，35（S1）：111-113.