利用正向重复片段的GUS报告基因检测DNA双链断裂引起的基因重组研究

1 绪论

随着生命科学的研究和发展，数量繁多的基因或其调控因子的功能需要鉴定，作为研究基因功能最为有效的方法，定点基因突变研究越来越受到人们的关注，基因组编辑(genome editing, GE)技术应运而生。因此，建立一种高效而又精确的检测基因定点突变技术是十分必要的。而检测GE的前提是能够检测DSB，但是传统的检测DNA双链断裂的方法较为复杂、繁琐。因此，构建简单、快速的此类检测技术是非常必要的。近年来，伴随着不同的核酸酶以及DNA结合蛋白的结构和性质的阐明，基因组编辑技术已推广及其应用到许多生物中。将DNA结合蛋白的识别结构域和核酸酶的切割结构域相结合，实现对任意的特定DNA序列进行定点识别与切割。造成的DNA产生DSBs，后者通过两种DNA修复方式，一种是HDR，另一种是非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)。HDR在有外源的同源DNA存在的情况下，能够实现对特定碱基的替换，即对点突变进行恢复。NHEJ则是在被切割处的DNA序列发生缺失或插入等的突变。目前被广泛应用的GE技术主要有人工介导的锌指核酸酶技术(zinc finger nuclease, ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)和由RNA介导的规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)技术，DSB经过细胞内源性修复机制(HDR或NHEJ)的修复从而实现基因的插入、缺失和碱基替换等基因突变，以达到引起不同细胞系或生物体中的基因组发生改变的目的。再者，GE是能够破译基因功能和可以应用到基因治疗的一种有力工具。而在CRISPR /Cas系统中，Cas9核酸内切酶识别所必需的原间隔序列的3’端含有的一个原间隔临近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，PAM区是CRISPR/Cas系统中Cas蛋白识别CRISPR的序列标记[1,2]，对双链进行切割。此外，最近的研究表明，该系统与ZFN和TALEN一样，可在非目标位点进行打靶，从而造成脱靶现象[3,4]。因此，对DNA双链断裂进行检测是研究GE产生及其效率的关键。DNA双链断裂的检测技术主要有以下几类。

考虑到割草机在工作的过程中，其电机功率除满足行走所耗的功率以外，还应有一定的储备功率，以克服短时间内的超负荷，还有传动效率的损失等。因此，选择割草电机的功率为35W，行走电机的功率为40W。

1.1 γ-H2AX检测方法

DNA损伤及双链断裂的检测方法有很多，目前最为常用的是γ-H2AX检测方法。组蛋白2A变异体(histone family 2A variant, H2AX)属于核心组蛋白H2A家族中的一个亚型。DNA损伤及双链断裂后，产生磷酸化底物。这些DSBs都具有快速诱导H2AX的大量磷酸化(γ-H2AX)和簇集的功能[5]。所以，γ-H2AX可以作为DNA的损伤标记[6]，通过检测γ-H2AX，进而可以检测DNA双链断裂，该方法在药理学和临床医学领域均有应用。

迄今为止，已经开发了很多种技术和方法来检测γ-H2AX， Rogakou等在正常的细胞受到外源性的物理辐射后观察到H2AX发生磷酸化，并导致γ-H2AX斑点出现[7]；在γ-H2AX斑点形成后，观察斑点的数目与DSB的数量呈正相关[8,9]。据此有研究表明，由γ-H2AX焦点的数量推算出的辐射剂量与DNA的DSB的数量曲线中可以计算出，每一个已经完成培养的正常的细胞可以在每单位辐射剂量(Gy)的电离辐射下造成有35-39个DNA的DSB损伤的出现[10]。而检测的方法主要包括(1)免疫荧光染色结合荧光显微镜分析方法：这个方法被应用于早期DNA损伤研究，主要利用荧光显微镜技术和显微镜成像技术[11]。如果是用人工进行分析，通过荧光显微镜检查是否有荧光标记的γ-H2AX 灶点。缺点在于人工进行操作，人为的观察可能会对实验结果造成影响和偏差较大[12,13]。如果是自动化分析，基于手动操作或者是全自动显微镜，对荧光染色并制成玻片标本的细胞拍照后，利用图像分析软件分析每个细胞核中的γ-H2AX 灶点的数目和分布以及它们的荧光强弱。利用自动化进行分析，相比较于人工分析，优点在于准确性高、结果更加可靠，而且相较于人工操作，自动化分析的速度更快，能够得出把所得的定量的结果直接进行图片保存，方便以后的分析[14]；(2)流式细胞术( flow cytometry，FCM) 分析方法：使用流式细胞仪分析经过免疫荧光标记的细胞，能够分析每个细胞核中的荧光强度，甚至能够测定含有荧光的细胞所占的百分比是多少[15]。这种方法的优点就在于速度快，准确性高。但缺点也是非常显著的，由于被分析的细胞被破坏，无法分析每个细胞核中γ-H2AX 灶点个数和分布[16]；(3)全细胞酶联免疫反应( Whole-cell ELISA assay) 检测方法：这种检测方法所依据的原理是利用使用过氧化物酶结合的第二抗体去替代免疫细胞化学方法中的荧光分子结合的第二抗体，然后过氧化物酶与底物进行反应，能够产生一定量的显色产物，从而得到细胞内γ-H2AX的含量。这种操作方法的优点就在于操作简单、速度快。但缺点是不能准确分析每个细胞核内的γ-H2AX 灶点数量和分布数据[17]。

总之，利用γ-H2AX对DNA双链的断裂进行检测，方法较为复杂，操作比较繁琐。再者，有部分细胞活动并不导致DSBs的产生，但是仍然有可能产生γ-H2AX，因此有必要针对具体应用进行预实验，优化实验条件，并分析γ-H2AX产生的机制；第三，虽然检测到的γ-H2AX 含量和DSBs呈正相关关系，但不能精确计算出后者产生的数量。

我们所构建的GRATEN系统，是由以下原件组成：① Pol III启动子。将编码gRNA的DNA克隆到该启动子下游，其中gRNA是针对目标DNA设计的；②FokI-MS2-FokI融合基因克隆。将FokI-MS2-FokI三个基因片段串联，二端加上核定位信号(Nuclear Localization Signal, NLS)，并在C端加6×His标签。将以上串联的基因克隆到植物表达载体35S启动子下。上述克隆经DNA测序验证。如图A所示，MS2蛋白可以形成同源二聚体结构，这个同源二聚体结构首尾反向平行，在MCP的两端连接FokI限制性核酸内切酶，形成一个结构形式为FokI-MS2-FokI的融合蛋白，命名为偶联核酸融合蛋白(tether-nuclease fusion proteins，TNPs)，所形成的这个二聚体会在靶DNA的R-Loop结构上游对DNA进行切割，造成DSBs。而在我们的实验中，就是对GU-US的重复片段进行切割，切割完成后，通过HDR途径恢复成有功能的GUS基因，然后，利用GUS基因的特性进行检测。

1.2 荧光报告基因检测

实验材料选择生长状况良好的本氏(Nicotiana Benthamiana, N. Benthamiana)烟草植株。

1.3 GRATEN系统

我们构建了引导RNA偶联核酸内切酶(guided RNA and tethered endonuclease, GRATEN)引起DSB的技术，基于序列重叠的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因[20]，通过HDR修复产生的基因突变进行恢复。GRATEN系统包含二个组分，一是串联的引导RNA (guided RNA， gRNA)和可与噬菌体MS2外壳蛋白(MS2 coat protein, MCP)结合的RNA；另一部分是融合的MCP和核酸内切酶FokI切割结构域基因。该系统的工作原理是，当gRNA与基因组的同源DNA配对形成R环(R-loop)结构后，与MCP结合的RNA通过将FokI引导至R-loop邻接区域，二聚体化的FokI切割DNA形成DSB，导致GE的产生(图A)。为了验证GRATEN系统产生DSB的可能性，我们在植物表达载体中构建了含有部分重复序列的GUS基因(35S-GUUS)。通过在烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中瞬时共表达GRATEN和35S-GUUS，GUS基因得到恢复。证明GRATEN导致序列特异性DSB以及利用35S-GUUS检测DSB是切实可行的。

B.PCR鉴定pBluescript Ⅱ KS-GUS1重组子得到1035bp片段琼脂糖凝胶电泳检测的结果。C. PCR鉴定pBS-GUUS重组子得到1413bp片段琼脂糖凝胶电泳检测的结果。D.酶切鉴定pBS-GUUS重组子琼脂糖凝胶电泳检测的结果。E. PCR鉴定p1305-GUUS重组子得到2423bp片段琼脂糖凝胶电泳检测的结果。

  

Figure A： GRATEN system

GRATEN系统载体的构建：在TNPs模块中，浅蓝色部分为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；核定位信号(NLS)(紫色部分)；核酸内切酶FokI(粉色部分)；噬菌体外壳蛋白MCP(黄色部分)；胭脂氨酸合成酶的转录终止子Tons(灰色部分)；在gRNA模块中，5'端的发夹结构以蓝色矩形表示、MCP binding以棕色矩形表示、gRNA以红色矩形表示；拟南芥Pol III启动子(AtU6)；5'端的发夹结构(Hp)；三个结合MS2的位点(3XMS2 binding)；对应基因组靶位点的gRNA(Target)；终止AtU6启动的翻译终止子，8个胸腺嘧啶(8T)。

对于绿色矿山，刘建兴认为绿色矿山是指能满足经济开采活动需要的同时，又保护了自然环境，实现人与自然和谐的矿山[16]。栗欣指出绿色矿山是可持续发展理念在矿业开发中的体现，既充分利用资源又有效保护环境[17]。刘建芬认为，绿色矿山是指在矿产资源的勘查开发过程中，既要实行严格科学有序的勘查开采，又要对矿区及周边的生态环境扰动最小，实现资源勘查开发效益的最大化，实现资源的绿色开发、绿色应用、绿色发展[18]。

Schematic of GRATEN system. In the TNPs, 35S promoter from cauliflower mosaic virus (CaMV) in white; nuclear localization signal (NLS) in purple; endonuclease FokI in pink; MS2 bacteriophage coat protein (MCP) in yellow; transcriptional terminator of nopaline synthase gene(Tnos) in gray; In the gRNA, the 5’ end hairpin, gRNA and MCP binding sites are denoted in blue, red and brown lines respectively. AtU6, promoter of polymerase III from Arabidopsis thaliana; Hp, 5’ end hairpin structure; 3×MS2 binding, triple MS2 binding sites; Target, target sequence in genomic locus. 8T, octuple thymines for terminating transcription driven by U6 promoter.

2 材料和方法

2.1 GRATEN系统的构建

公摊面积计算“水太深”。据媒体报道，山东省高密市曾出现一处名为“贵宾首府”的“神盘”，多部门联合验收文件显示公摊系数高达52.35%，被称作“史上最牛公摊面积”。面对业主维权，工作人员十分硬气：“法律对公摊上限没有规定，你们100年都退不了房!”

  

引物名称引物序列NGUS5’5'ggacggtaccccatggtagatctgagggta 3'NGUR5'agacatcgatggtcagtccgtcgt 3'NUSF 5'gagcgaattcaagagggcctcggaaaagtc 3'NGUS3’ 5'aattggatccggtcaccaattcacacgtga 3'

我们的模板选择载体质粒pBluescript II KS-GUS1进行PCR的扩增，NGUS5’和NGUR作为扩增引物，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，能够检测到扩增产物为1035bp的GUS1片段(图B)；我们的另外一个扩增是以NUSF和NGUS3’为引物，以载体质粒pBS-GUUS为模板，检测到扩增产物为1413bp的GUS2片段(图C)；若载体变为Nco I和Bste II双酶切载体质粒pBS-GUUS，则是2423bp的GUUS片段(图D)；以载体质粒p1305-GUUS为模板，以NGUS5’和NGUS3’为引物进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳检测，即得到2423bp的GUUS片段(图E)。

 

为琼脂糖凝胶电泳检测结果图

Figure：Agarose gel electrophoresis detection results

She was busily searching through the neighbourhood for a proper situation for her daughter...[3]

B. PCR amplified DNA from pBluescript Ⅱ KS-GUS1, the arrow indicate 1035bp. C. PCR amplified DNA from pBS-GUUS, the arrow indicate 1413bp. D. Restriction endonuclease digestion for pBS-GUUS， the arrow indicate 2423bp. E. PCR amplified DNA from p1305-GUUS , the arrow indicate 1035bp.

2.2 植物材料及转基因操作

还有一种方法是利用荧光报告基因来检测DSB。这种方法是通过构建突变的荧光蛋白载体来实现的。该技术又分为二类，一是构建在荧光蛋白基因内部插入含有终止密码DNA片段载体，当经过GE导致插入DNA片段产生突变后，一部分荧光蛋白基因的读码框恢复功能，因而可通过检测荧光来检测DSB[18]。但该方法只能检测到使荧光蛋白基因恢复读码框的突变，而其余的则不能检测到；第二类是构建含有重复DNA片段的荧光蛋白或其他报告基因的载体，当经过GE导致重复DNA片段产生突变后，经过HDR修复使荧光蛋白基因的读码框恢复功能，因而可通过检测荧光来检测DSB[19]。但目前该方法在植物突变研究中，主要在转基因植物中进行，实验耗时长。

将构建的重组载体质粒与对照共同转化农杆菌，将含表达载体的农杆菌转接种于LB液体培养基培养直至对数生长期，离心收集菌体，然后加入渗透注射缓冲液，重悬至OD600 值约为 0.5～1.0，遮光条件下室温静置 2～3 hrs后用于渗透注射。渗透注射苗龄为4周左右的烟草叶片，采用农杆菌渗入法侵染烟草叶片，用针头在植株叶片上扎两个孔，用无针头的注射器对叶片进行注射，依靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间，实现农杆菌介导的植物瞬时表达。渗透注射后的烟草植株在弱光条件下培养一天，然后放于可见光下正常培养，瞬时表达48h后取材进行实验。

2.3 GUS染色及观察

(1)GUUS表达载体。35S及NOS-T分别为启动蛋白表达的启动子和终止子，两个灰色方框(U)表示GUS基因内部重复片段，gRNA的识别和切割序列用箭头来表示；(2) GUS-Rec与我们所设计的载体共同表达，经gRNA引导并经TNP切割产生DSB，GUS基因内部重复片段间经同源链交换重组；(3)GUS基因恢复正常阅读框。

目前关于干部网络教育的研究主要集中于干部网络教育的现状、存在的问题、改革的建议等问题，对于干部网络教育中技术的应用及发展趋势的研究较少。而随着互联网技术的迅速发展以及干部个性化、智能化学习需求的不断凸显，技术在干部网络教育中的应用是值得思索的问题。

 

F. GUS-Rec系统检测基因定点突变示意图

FigureF.The schematic of GUS-Rec mutation detection system

GUS-Rec系统的工作原理(详见图F)，我们通过将构建的载体质粒与p1305-GUUS载体质粒转化农杆菌，共同渗透注射4周左右苗龄的烟草叶片，进行农杆菌植物瞬时表达，培养三天后剪下叶片进行GUS染色和观察。

(1)GUUS expression vector. 35S and NOS-T are promoter and terminator for gene transcription respectively, two gray boxes (U) represent the direct repeats of intenal GUS gene, gRNA recognition and cleavage sequence represented by arrows. (2)GUS-Rec and the vector are expressed in one cell simultaneously, after gRNA guiding and cleavaged by TNP , producing DSB, GUS gene can be restored between direct repeat sequences by single-strand invasion, strand exchange and homologous recombination.( 3)GUS gene recover to normal reading frame.

3 结果

观察瞬时表达GUS，得到了以下的结果：空载体瞬时表达后，经GUS染色后没有颜色(如图G-1)；以gRNA作对照，经GUS染色后没有颜色(如图G-2)；GUS表达体瞬时表达后，经GUS染色呈现出蓝色(如图G-4)；只转化p1305-GUUS载体质粒的叶片，经GUS染色后不会出现蓝色(如图G-3)；共同转化p1305-gRNA-FMF载体与p1305-GUUS载体，能够瞬时表达GUS，经GUS染色后呈现出部分蓝色(如图G-5)，为了避免因叶片状态对瞬时表达造成的影响，观察同一叶片瞬时表达，如图G-6。说明GUUS基因经切割重组后恢复为正常读码框的GUS基因，并翻译成GUS蛋白。并且这种发生在GUS基因内部重复区的位点特异性双链断裂是由gRNA引导的，而且是由二聚体FokI切割产生的。因此我们证明我们设计的GRATEN系统能够在特定位点进行切割，并且由切割产生的DSB及其经HDR修复的效率较高(约为35%)，该技术系统可用于快速检测基因组编辑产生的特异位点DNA切割及其HDR修复。

图G GUS染色结果

FigureG. The results of GUS staining

GUS载体瞬时表达用蓝色圈；GUUS+gRNA载体共同瞬时表达为红色圈；GUUS载体瞬时表达为黑色圈。

Blue circle represents the result of transient expression ofGUS; Red circle represents the result of transient co-expression of GUUS+gRNA; Black circle represents the result of transient expression of GUUS.

4 结论

利用报告基因检测位点特异性DSB不仅可用于验证GE致突变的特异性和效率，而且可研究各种生物和非生物致突变剂对DNA的损伤程度，同时也可研究动植物在生理条件下产生DSB及其损伤修复机制。已有的检测DNA的DSB技术存在以下缺点：(1)操作步骤繁琐。如γ-H2AX检测方法；(2)结果不稳定。如利用荧光报告基因进行的检测，一是需要荧光显微镜。二是在进行检测时，在紫外光下荧光会迅速产生淬灭，对精确统计结果有影响；三是植物细胞会产生自发荧光，对结果存在干扰；(3)植物中尚缺乏快速、稳定检测方法。植物中利用GUUS系统只运用于转基因植物的DSB及其DNA重组研究，尚未发现利用其检测基因瞬时表达的研究。我们的实验结果具有以下的优点：(1) 实验步骤简单，得到结果较快。整个实验过程只需2-3天即可得到结果。相较于转基因植物具有较高的效率，并且可作为后者的先期验证性实验；(2)GUS染色稳定，结果重复率高；(3) GUS染色是经 β-葡萄糖醛酸酶(beta-glucuronidase)催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)而产生蓝色反应物，由于酶促反应具有较高的效率，因此我们推测利用GUS基因恢复技术可检测发生频率较低的基因组DSB；(4)首次发现GRATEN系统可产生位点特异性的DSB，并且其切割DNA效率较高。该系统具有以下特点：(1)设计、构建打靶载体简单。因为与MCP结合RNA以及MCP：FokI融合蛋白只需构建一次，只需将针对特定基因组序列的gRNA构建到载体中U6启动子的下游。(2)系统作用效率高。由于gRNA与MCP：FokI融合蛋白在同一载体上，可实现在同一细胞中同时高效表达以上二个组分及其产生作用的目的，避免了因RNA和蛋白分别在二个载体表达，从而需要共同侵染植物而产生的共表达效率低的弊端。

作者贡献：

曹雪松老师负责实验的设计，鲍岳主要负责实验的完成和数据的分析以及论文的撰写，张俊华和苏振华负责实验的协助进行，全体作者阅读并同意全文。

在幼龄果树的行间空地种植粮食作物或经济作物，可以增加果园收入，达到“以短养长”的目的。果园间作还能对土壤起到覆盖的作用，防止水土流失，增加土壤有机质，提高土壤肥力。贵州常见的间作物有玉米、红薯，这是不合理的。此外，白菜、萝卜、麦类等也不适宜间作，因为这些间作物吸肥能力强，会使果园地力严重下降。豆类作物植株矮小，根系具有固氮作用，与果树不争肥，既增加经济效益又增加土壤肥力。

参考文献：

[1]Mojica F J M, Díez-Villase or C, García-Martínez J, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system[J]. Microbiology, 2009, 155(3)：733-40.

[2] Brouns S J J, Jore M M, Lundgren M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J]. Science, 2008, 321(5981)：960-964.

[3]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science, 2012, 337(6096)：816-821.

[4] Cong L, Ran F A, Cox D, et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems[J]. Science, 2013, 339(6126)：819-823.

[5] Fernandez-Capetillo O, Lee A, Nussenzweig M, et al. H2AX： the histone guardian of the genome[J]. DNA Repair, 2004, 3(8-9)：959-967.

[6] Paulsen R D, Soni D V, Wollman R, et al. A genome-wide siRNA screen reveals diverse cellular processes and pathways that mediate genome stability[J]. Cell 2009, 35(2)：228-239.

[7] 黄鹏程,周长慧,常艳.基于γ-H2AX生物标志物DNA遗传毒性检测方法的研究进展[J].中国新药杂志, 2016, 25(4)：418-424.

[8] Rogakou E P, Boon C, Redon C, et al. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo[J]. Cell Biology, 1999, 146(5)：905-915.

[9] Rogakou E P, Pilch D R, Orr A H, et al. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139[J]. Biological Chemistry, 1998, 273(10)：5858-5868.

[10] Rothkamm K, Lobrich M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low X-ray doses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2003, 100(9)：5057-5062.

[11]Martin O A, Rogakou E, Panyutin I G, et al. Quantitative detection of 125IdU-induced DNA double-strand breaks with γ-H2AX antibody[J]. Radiation Research Society, 2002, 158(4)：486-492.

[12] Scarpato R, Castagna S, Aliotta R, et al. Kinetics of nuclear phosphorylation(γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C[J]. Mutagenesis, 2013, 28 (4)：465-473.

[13] Runge R, Hiemann R, Wendisch M, et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced γ-H2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES[J]. International Journal of Radiation Biology, 2012, 88 (5)：439-447.

[14] Bourton E C, Plowman P N, Zahir S A, et al. Multispectral imaging flow cytometry reveals distinct frequencies of γ-H2AX foci induction in DNA double strand break repair defective human cell lines[J]. Cytometry , 2012, 81(2)：130-137.

[15] Rothkamm K, Horn S, Scherthan H, et al. Laboratory intercomparison on the γ-H2AX foci assay[J]. Radiation Research Society, 2013, 180(2)：149-155.

[16] Turenr H C, Brenner D J, Chen Y H, et al. Adapting the γ-H2AX assay for automated processing in human lymphocytes. 1. Technological aspects[J]. Radiation Research Society, 2011, 175(3)：282-290.

[17] Ivashkevich A, Redon C E, Nakamura A J, et al. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research[J]. Cancer Letters, 2012, 327 (1-2)：123-133.

[18] Certo M T, Byoung Y R, James E A, et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints[J]. Nature Method, 2011, 8(8)： 671-676.

[19] Siebert R, Puchta H. Efficient repair of genomic double-strand breaks by homologous recombination between directly repeated sequences in the plant genome[J]. The Plant Cell, 2002, 5(14)：1121-1131.

[20] Swoboda P, Gal S, Hohn B, et al. Intrachromosomal homologous recombination in whole plants[J]. The EMBO Journal. 1994, 13(2)：481-489.