浓香型大曲中1株高发酵力芽孢杆菌的筛选和鉴定

我国酿酒已有几千年的历史，用曲酿酒是我国古代劳动人民的重大发明。目前中国白酒是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂[1]，经蒸煮、糖化、发酵和蒸馏而制成的饮料酒，在世界六大蒸馏酒中别具一格。酒曲作为酿酒过程中的糖化、发酵和生香剂，具有丰富的微生物和酶系，对形成白酒的香型及质量具有重要作用[2]。因此，在我国传统酿酒行业一直流传着“曲乃酒之骨”[3-4]的说法。传统浓香型大曲以泸型曲为代表，是以小麦为原料，经粉碎、加水拌和压制成曲醅[5]，经天然接种多种微生物共同发酵而成的微生态制品。

作为中国传统酿造的浓香型白酒大曲，其微生物种类是非常丰富的。大曲微生物包括细菌、酵母、霉菌和放线菌[6-7]。大曲中的细菌主要有乳酸菌、醋酸菌、芽孢杆菌。高温大曲中的细菌多为芽孢杆菌[8]。芽孢杆菌在自然界中广泛分布，与其他微生物相比，具有耐酸、耐盐、耐高温[9-10]等优点。大曲中芽孢杆菌群可以产生蛋白酶、液化酶、淀粉酶、酒化酶、纤维素酶等多种酶类[11]。酱香型大曲生产过程对酱香风味有较大贡献的芽孢杆菌包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，黄永光等[12]研究表明，芽孢杆菌群提高了固态发酵代谢产物吡嗪类、酯类、醛类、醇类等风味物质的含量。浓香型大曲中的芽孢杆菌群具有分解蛋白质和淀粉的功能，是生成芳香族化合物的重要菌源[13]。而大曲作为糖化发酵剂，发酵力指标是衡量大曲质量的重要指标，与之相关的微生物是研究热点[14]。现在科学工作者主要关注酵母的发酵力[15]，研究芽孢杆菌的发酵力相对较少。据酱香型白酒研究报道：芽孢杆菌对白酒发酵力具有一定的贡献。因此，研究芽孢杆菌对大曲发酵力的贡献将成为趋势。

本研究采用平板透明圈初筛和固态发酵复筛的方法，从传统浓香型大曲的不同制曲阶段筛选高发酵力的芽孢杆菌，为丰富大曲菌种资源库和研制强化大曲奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

牛肉膏(生化试剂)，北京双旋微生物培养基制品厂；蛋白胨(生化试剂)，北京奥博生物技术有限责任公司。氯化钠(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；琼脂，福建石狮市琼脂副食品加工厂闽南琼胶有限公司；葡萄糖(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2 浓香型大曲

分别取自泸州老窖制曲生态园安曲0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、12 d、15 d、30 d、60 d、100 d的样品。

显然，对联通来说，无论移动采取什么策略，联通只要采取不涨价策略都可以获得更优的支付。对于移动来说，无论联通采取什么策略，移动只要采取不涨价策略都可以获得更优的支付。这样不涨价就是两个公司的占优策略，所以两家公司都会采取不涨价策略，各获得50的支付(50,50)。当该博弈处于(不涨价，不涨价)策略组合时，联通和移动都无法通过改变自己的策略来获得更好的支付，于是博弈到达纳什均衡状态。

1.1.3 培养基

平板筛选培养基[16]：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L，pH7.4～7.6，121 ℃灭菌30 min。

单项运动本身所具有的魅力足以吸引大众的参与，形形色色的项目汇聚在一起时反而会显得杂乱无章，凸显不出小镇的特色。聚焦于自身优势，把一个项目做到极致，让大众在体验中真正感受到这项运动的韵味，培养运动锻炼的兴趣，这便是体育特色小镇建造宗旨的关键所在。

TTC下层培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.4～7.6，121 ℃灭菌30 min。

TTC上层培养基：TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，琼脂1.5 g，加入100 mL水，在沸水中溶解。

“给个面子嘛是不是。下一步干啥不管，这里买了就都开心是不是，多多少少买一点。”⑦(之后有的游客果然返回柜台开始买东西)顿珠导游，云南。

小麦固体培养基[17]：经适度粉碎的小麦粉20 g，蒸馏水20 mL，分装于250 mL锥形瓶，121℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

发酵力的计算公式：

扩大种子培养液：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.4～7.6，121 ℃灭菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 芽孢杆菌的筛选

无菌条件下取约20 g大曲样品放入研钵中，待样品充分分散后于无菌条件下称取10 g样品放入装有90 mL无菌水的灭菌三角瓶，置于摇床（37℃，200 r/min）振荡30 min，于85℃水浴锅中处理10 min，淘汰非芽孢杆菌[18-19]。然后梯度稀释至10-6，选取10-4、10-5、10-6，3个稀释梯度，各取0.5 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，每个稀释度做3个平行，将涂布的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24 h，挑取培养基上不同形态的菌落进一步纯化培养，直到形成单菌落再接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，然后4℃保存备用。

1.3.2 具有发酵力的芽孢杆菌平板初筛

将斜面保藏的芽孢杆菌菌株活化后点接到TTC下层培养基上，于37℃恒温培养箱中倒置培养24 h，取出培养好的平板，用TTC上层培养基覆盖整个平板，待显色后观察菌株的颜色，记录各菌株的颜色，通过颜色（红色）深浅不同初步筛选出具有发酵力的芽孢杆菌，颜色越深，说明发酵能力越强。

1.3.3 高发酵力芽孢杆菌的固态发酵复筛

无菌操作条件下，用移液枪将具有发酵力的芽孢杆菌种子培养液以10%(v/m)的接种量接种到固体培养基中，用棉塞封口，将接种好的培养基于37℃恒温培养箱中静置培养5 d，发酵结束后检测所接芽孢杆菌的发酵力指标。同时做空白对照实验。

1.3.4 芽孢杆菌发酵力的测定[20]

首先，取适量高粱粉制成7°Be糖化液。然后，取50 mL糖化液于100 mL锥形瓶和发酵栓一起进行灭菌。最后，等灭菌温度降低到28℃时将0.5 g固体发酵产物加到锥形瓶中进行发酵，放在分析天平上称取，读数为M1（空白试验读数为M3）。置发酵栓于30℃培养箱中，发酵72 h，取出发酵栓，轻轻摇动，使二氧化碳逸出，称量后记下读数M2（空白试验读数为M4），利用计算公式计算发酵力的大小。

JA2003分析天平，上海衡平仪器仪表厂；HHS恒温水浴锅，江苏省金坛市正基仪器有限公司；LS-50HJ立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司；LRH-250生化培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；Haier医用低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司；DHG-140B智能型电热鼓风干燥箱，上海琅轩实验设备有限公司；糖度计。

M3——空白实验发酵前发酵栓与内容物总质量，单位为克（g）；

X=（M1-M2）-(M3-M4)

式中：X——试样的发酵力，单位为U；

绘画描绘了属于孩子自己的想法、感觉、情绪。然而大多数的孩子较自然且自发地运用动作用非语言的行为来表达自己，且非常喜欢画人物，似乎在其图画中蕴涵着许多特殊或有意义的含意。

M2——发酵后发酵栓与内容物总质量，单位为克（g）；

经过三年的实验教学改革和实践，机械基础实验教学条件和教学质量得到了很大的改进和提高。截止目前，机械基础实验教学无论从实验硬件条件还是实验教学师资情况已完全能够适应中职-本科衔接项目的教学要求。

M4——空白实验发酵后发酵栓与内容物总质量，单位为克（g）。

1.3.5 芽孢杆菌固态发酵产物的挥发性物质测定

HS-SPME的操作方法：将固相微萃取装置的萃取头在气相色谱的进样口老化，温度为250℃，时间为5 min。称取1 g发酵产物于15 mL装样瓶中，在60℃条件下平衡15 min。将固相微萃取萃取头插入样品瓶中，萃取30 min后，插入GC-MS进样口中检测发酵产物的挥发性物质。

GC-MS测定条件：最高温度为230℃，程序升温；进样量1 μL，进样方式为手动不分流，进样口温度为230℃；质谱电离源EI；采集方式为全扫描；溶剂延迟3 min；离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃；增益系数1。

1.3.6 芽孢杆菌的分子生物学（16S rDNA）鉴定

引物：27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，由上海生物工程公司合成，PCR反应体系（30.2 μL）：Template 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶 0.2 μL,F 0.5 μL，R 0.5 μL，加双蒸H2O 25 μL,PCR反应程序：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 45 s，72℃延伸1 min，循环30次，4℃保存。

基因测序由上海生物工程公司完成，采用DNAstar将测序结果进行序列拼接和去除多余的碱基后，登录NCBI进行BLAST分析，采用MEGA6进行发育树构建，重复取样1000次进行bootstrap。

M1——发酵前发酵栓与内容物总质量，单位为克（g）；

2 结果与分析

2.1 浓香型大曲中具有发酵力芽孢杆菌的初筛结果

传统浓香型制曲工艺翻曲大概在10 d；本实验取样在冬季，浓香型大曲翻曲在第12天。在这11株显深红色的菌株中，编号为X23菌株仅出现在制曲0～12 d时间段，编号为X11、X38、X40菌株仅出现在制曲15～100 d时间段，其余7株菌株在整个制曲时间段都存在。经研究发现，制曲0～100 d，每个时间段都有可能出现高发酵力的芽孢杆菌。通过平板显色可以初步体现菌株发酵力的高低，发酵力大小还需要进一步检测。

由表1可知，有11株芽孢杆菌显色颜色为深红色，可初步判定有11株芽孢杆菌发酵能力较强，有27株芽孢杆菌发酵能力相对弱，其余5株芽孢杆菌无发酵力。从图1可以看出，编号为X13形成的菌落显色颜色为深红色，编号为X22形成的菌落显色颜色为浅红色。

从取自泸州老窖制曲生态园不同发酵阶段的样品，共筛选到43株芽孢杆菌，经过TTC显色初筛，共筛到11株芽孢杆菌显色深，结果见表1。其中菌株X13、菌株X22显色对比结果见图1。

首先，我们根据他电话中提供的个人信息，核实了他是本单位在册在岗员工，查询到了他所在的作业单元。紧接着，我们联系了具体负责该项事务的劳资员，说明了有关情况。负责他所在作业单元劳资工作的员工虽显紧张，但积极且迅速地配合了我们的工作。她先查询了她负责的工资表情况，核实无误，又致电了对接其工作的财务人员，确认工资已上账，便立马将情况反馈给我们。

在课堂教学时，转变过去满堂灌的讲授教学法，结合互联网和各种在线学习平台，采用启发式、趣味性的混合教学方法．改变过去教师上课时，只需一根粉笔、一个黑板就可以授课的模式．不仅教师讲得辛苦，而且学生也听得困难．学生被动地学习，掌握和理解的内容自然就比较少．因此，必须发挥学生在课堂中的主体地位，激发学习的积极性和主动性．例如：教学时，利用“雨课堂”等软件，增加教师与学生的互动，并对课堂信息进行统计，分析学生的掌握理解情况，并适当增加知识性的趣味游戏，让学生“乐学”起来，最终达到掌握知识的目的．

 

表1 芽孢杆菌的TTC平板初筛结果

  

注：++++表示TTC反应显深红色，+++表示TTC反应显红色，++表示TTC反应显浅红色，+表示TTC有显色反应，—表示TTC无显色反应。

  

图1 菌株X13、X22菌落TTC显色结果图

2.2 高发酵力芽孢杆菌的固态发酵复筛

选取初筛结果中颜色显深红色的菌株进行固态发酵，并对其发酵产物的发酵力进行测定。结果见表2。

2.1 两组患者疗效比较 25.0%(10/40)的手术组患者术后出现声音嘶哑、肌痛、肠胃不适及高血压等并发症，显著高于研究组的7.5%(3/40)，差异有统计学意义(P<0.05)。研究组的治疗总有效率为97.5%(39/40)，显著高于手术组的90.0%(36/40)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

从表2可见，固态发酵复筛所得菌株X13发酵力最高为0.49 g/0.5 g·72 h，达到了传统大曲指标[21]的优良等级。因此，选取发酵力最高的菌株X13进行发酵产物的GS-MS和16S rDNA的鉴定实验。

 

表2 芽孢杆菌固态发酵复筛检测结果

 

2.3 菌株X13发酵产物的GS-MS分析结果

对菌株X13进行固态发酵，用HS-SPME-GCMS方法对菌株X13发酵产物进行分析，初步探寻芽孢杆菌和风味物质之间的相关性。空白实验挥发性化合物和菌株X13挥发性化合物的总离子流色谱图见图2和图3。

  

图2 空白实验挥发性化合物的总离子流色谱图

  

图3 菌株X13挥发性化合物的总离子流色谱图

 

注：1为乙偶姻；2为2,5-二甲基吡嗪；3为苯甲醛；5为正硅酸乙酯；9为愈创木酚。

菌株X13的固态发酵产物采用HS-SPMEGC-MS的方法，得到的挥发性化合物有23种，在爱化学数据库对比物质标号能查到的挥发性物质有17种（见表3），包括吡嗪类、酚类、醇类、醛类和酯类等物质；空白实验得到的挥发性化合物有6种，其中能在爱化学数据库查到的风味物质有3种；菌株X13挥发性化合物相对含量大于5%且在爱化学数据库可以查到的挥发性化合物在图3均已标注。菌株X13固态发酵和空白实验挥发性物质相比较多了14种风味物质，同时含有大曲主要香味成分。吡嗪类物质一般都具有坚果香味[22]，醇类、醛类、酯类均会产生一些令人愉快的气味，有些醇类和醛类具有水果香味，这些风味对浓香型大曲曲香的形成有一定的贡献[23]。固态发酵产物中检测到苯乙醇、愈创木酚为优质浓香型大曲的主要香味成分[24-25]。吡嗪类物质、愈创木酚、苯甲醛的形成与淀粉水解及蛋白质水解作用相关。菌株固态发酵产物中的挥发性物质，经过大曲多菌共酵以及窖池发酵的转化过程，可能成为大曲和白酒风味成分的前体或中间转化物。因此，菌株X13与大曲的风味物质产生以及白酒风味具有一定的内在联系。

这是写给其表兄兼老师叶中孚的信(据《中峰集》卷四《送叶中孚序》，董氏小时曾从表兄叶中孚学《易》，两人处在师友之间)，文词十分幽默。他对自己的道德品行极为自信，认为自己是洁身自好的人，即使是烂醉如泥，还可参与祭祀天地。而对叶中孚由于世风日坏从而对朋友的洁身自守产生的怀疑，以为是疑非所当疑。文中用了“斩关而责穿窬”、“滥醉犹可祀天地”之语，诙谐生动，体现了朋友的亲密无间关系。这让我们看到董氏也并总不是一个一本正经板着面孔说教的经师，他也还有抒发其性灵的时候。

 

表3 菌株X13挥发性化合物及空白实验相对含量

 

2.4 菌株X13的菌落形态及其16S rDNA的鉴定

2.4.1 菌株X13的菌落形态（图4）

  

图4 菌株X13菌落形态及细胞形态

 

注：a.菌株X13菌落形态；b.菌株X13细胞形态。

从图4可知，菌株X13在牛肉膏蛋白胨培养基上培养12 h后形成淡白色、不规则椭圆形、透明、湿润的菌落，菌落中间透明，边缘相对于中间透明度降低，不产色素。同时，菌株X13在电镜下进行观察，细胞呈杆状。

2.4.2 菌株X13的分子生物学鉴定

对菌株X13进行DNA提取，PCR后跑凝胶电泳，其PCR凝胶电泳图见图5。菌株X13的16S rDNA基因序列进行测定后，经BLAST对比，采用MEGA6进行发育树构建，菌株X13的系统发育树见图6。结果表明，菌株X13的基因序列与Bacillus velezensis相似度较高，X13可鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

  

图5 菌株X13 PCR凝胶电泳图

3 结论

从浓香型大曲中分离出1株高发酵力细菌，其发酵力为0.49 g/0.5 g·72 h。经过16S rDNA鉴定结果显示，该菌株与Bacillus velezensis（贝莱斯芽孢杆菌）同源性最高，达100%，可鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。HS-SPME-GC-MS结果显示，菌株X13发酵产物中含有大曲的主要风味成分，如2,5-二甲基吡嗪、苯乙醇、愈创木酚等化合物。菌株X13不仅具有高的发酵力而且发酵产物含有浓香型大曲的主要风味成分，可以确定X13为大曲的功能菌株。

  

图6 菌株X13的系统发育树

本研究从浓香型制曲的不同时间点取样，筛选出高发酵力功能的菌株，该菌株为白酒酿造丰富菌种资源库。由于时间和实验条件原因，本研究仅对主要功能特性和代谢产物进行初步探究，关于菌株的其他功能特性，其代谢产物和浓香型大曲风味成分之间的相互关系还需进一步研究。

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