侧柏叶生发酒提取工艺的优化

侧柏叶为柏科植物侧柏（Platycladus orientalis(L.)Franco）的干燥枝梢和叶。中医认为侧柏叶气清香，味苦涩，性寒，归肺、肝、脾经，具有凉血止血、化痰止咳，生发乌发之功效，用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺热咳嗽、血热脱发、须发早白[1]。侧柏叶作为传统的中药，其乌发功能一直被人忽略。而在诸多古今文献中记载其主要功能为乌发和生发，在《本草纲目》中谓其：浸油，生发，烧汁，黑发。和猪脂，沐发长黑[2]。侧柏叶单独或配伍白鲜皮、何首乌、骨碎补等浸酒，浸液外涂患处，治疗脱发效果良好[3]。鲜侧柏叶浸泡于60%vol的酒精中，7 d后滤取药液，涂擦毛发脱落部位，每日3次可治疗脂溢性皮炎与脱发、发早白等[4-7]。赵永光等[8]研究认为，侧柏叶的生发乌发作用主要在于侧柏叶总黄酮提取液可激活毛母细胞和促进头皮血液循环，复活毛发生长能力衰退的毛囊和促进血液循环，增加头部的营养成分而发挥养发、生发作用。本实验采用正交试验设计，以总黄酮含量、槲皮苷含量的综合评分为指标，考察乙醇体积分数、料液比、浸提时间对侧柏叶生发酒提取工艺的影响，优化侧柏叶生发酒的提取工艺。

教无定法，只要得法。在习作教学中只要能培养学生写作的兴趣和热情，为孩子一生的语言能力奠定坚实的基础，就是成功的习作教学。

切实有效保护有机农业植物，不仅需要始终坚持科学合理的工作理念，同时还需要严格按照相关规定和标准，强化有机农业植物的保护工作落实到位，提升有机农业植物的整体生长水平。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

试药：鲜侧柏叶药材购自北京同仁堂，经鉴定为柏科植物侧柏（Platycladus orientalis(L.)Franco）的干燥枝梢和叶。芦丁(四川省维克奇生物科技有限公司，批号为wkq16101104，纯度＞98%)，槲皮苷(四川省维克奇生物科技有限公司，批号为wkq16080402，纯度＞98%)。水为纯净水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

仪器设备：Waters2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，UV-1800紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；CP124C型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；RT-04型粉碎机，北京兴时利和科技发展有限公司)。

1.2 试验方法

见实验步骤及方法。

2 结果与分析

2.1 侧柏叶总黄酮的含量测定

2.1.1 供试液的制备

对照液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10.74 mg于小烧杯中，取适量甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，定容至50 mL摇匀，即得芦丁对照品母液（每1 mL中含无水芦丁0.21 mg）。

预防措施：如在地质较软处施工时应当先在表面铺设一定厚度的碎石，碾压密实后在钻机底部垫入方木，增大钻机与地面的接触面积，以减少压强避免位移现象。在地质极为恶劣的地区，应当采取换填的方式来增加土层的稳定性。并且在冲孔施工时注意观察钢丝绳的走向，如垂直方向有较大偏差时应采取一定的措施，直至走向垂直。

样品溶液的制备：精密量取5 mL侧柏叶酒，置于水浴上蒸干，以甲醇溶解，过滤，滤液至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀即得[9]。

2.1.2 实验条件的选择

2.1.2.1 吸收波长的确定

精密吸取槲皮苷对照品溶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得槲皮苷系列对照品溶液。将各对照品溶液，按2.2.1项中色谱条件测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得槲皮苷回归方程为Y=27595X+629（R2=0.9996），线性范围为3.864～13.524 μg。

2.1.2.2 标准曲线制备

取侧柏叶酒样品，按照2.2.3项中处理方法平行制备5份，按照2.2.1项中的色谱条件进样，计算含量。其RSD为0.8%，表明该方法重复性良好。

精密量取侧柏叶酒1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，进样前用0.45 μm微孔滤膜滤过。

  

图1 芦丁标准曲线

2.1.2.3 样品含量的测定

吸取待测样液10 mL及10 mL蒸馏水作为空白对照，分别置于50 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液2 mL，摇匀，放置6 min(不断振摇)，加入10%硝酸铝溶液2 mL，摇匀，放置6 min(不断振摇)，加1 mol/L氢氧化钠溶液20 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，在分光光度计500 nm波长处测定吸光度，对比标准曲线，计算总黄酮含量，结果见表1。

2.1.3 重复性实验

取待测样液6份，按照方法2.1.2.3测定样液的吸光度，根据标准曲线的回归方程和稀释倍数，计算侧柏叶酒中的总黄酮含量，得到RSD=2.59%（n=6），重复性良好。

2.1.4 加样回收率实验

中国篮球界现在有两个著名的“大”人物，一个是大纪，一个是大龙。前者是山东男篮当年的“老黄牛”“邮差”；吴庆龙作为东北大帅，当年赫赫有名，是谓“大龙”。两人联手掌控山东西王男篮，曾经让人有诸多的幻想，那就是，山东男篮的“牛龙时代”已经来临。

2.2 槲皮苷含量的测定

2.2.1 色谱条件

 

表1 侧柏叶酒中总黄酮回收率实验

 

  

图2 侧柏叶酒的HPLC

 

注：1.槲皮苷；A.槲皮苷对照品；B.供试品。

Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），流动相为甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液-冰醋酸（40∶60∶1.5），检测波长 254 nm[1，12]，体积流量1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，见图2。

取已测定含量的侧柏叶酒样品溶液，按照已知含量的80%、100%、120%加入芦丁标准品，按照方法2.1.2.3测定回收率，结果见表1。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取槲皮苷对照品4.83 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，添加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备

分别精确量取标准芦丁溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL和12.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，各加水至12 mL，添加5%的亚硝酸钠溶液2.0 mL，混匀，放置6 min，加10%的硝酸铝溶液2.0 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L的氢氧化钠试液20.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，在分光光度计500 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得出标准曲线的回归方程。线性回归方程为y=11.735x-0.0101，相关系数R2=0.9996。标准曲线见图1。

2.2.4 线性关系考察

取侧柏叶酒1号样品溶液10 mL置于50 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液2 mL，摇匀，放置6 min(不断振摇)，加入10%硝酸铝溶液2 mL，摇匀，放置6 min(不断振摇)，加1 mol/L氢氧化钠溶液20 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，采用分光光度计法，200～800 nm处扫描，由扫描结果确定测定波长为500 nm[10-11]。

 

表2 槲皮苷的加样回收率试验

 

2.2.5 精密度试验

精密量取已知含量的侧柏叶酒1 mL，分别按含量的80%、100%、120%加入槲皮苷对照品溶液，按照2.2.1项中的色谱条件进样，计算槲皮苷的平均加样回收率为100.60%、100.30%、101.01%，RSD为1.89%、1.49%、1.19%，结果见表2。

在经济发展、科技进步的今天，越来越多材质的产品出现，盖罐一个实用器物慢慢地退出了人们的生活圈不为大家所熟知。以长久的文化传承的角度，我们应该走可持续发展的道路，更好更多地了解盖罐的传承，注入新时代的思想，传承传统文化。

2.2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h按照2.2.1项中色谱条件进样，测得槲皮苷质量浓度的RSD为0.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验

实时荧光定量PCR检测 Trizol 法提取总RNA，反转录合成cDNA，按实时荧光定量 PCR试剂盒中说明书操作，在 PCR仪上进行实时定量检测[cDNA合成相关试剂、实时荧光定量 PCR试剂盒等由宝生物工程(大连)有限公司提供]。对实验结果采用 2-[△△ct]的方法进行分析。

2.2.8 加样回收率试验

分别取2.2.4项中槲皮苷高、中、低3个质量浓度的对照品溶液，按照2.2.1项中色谱条件，每个浓度分别重复进样5次，槲皮苷高、中、低质量浓度的RSD分别为0.2%、0.6%、1.0%，表明仪器的精密度良好。

2.3 侧柏叶生发酒制备工艺的优化

选用L9(34)正交试验，以总黄酮含量、槲皮苷含量的综合评分为指标，考察乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取时间(C)对提取效果的影响，从而确定最佳提取工艺条件。权重分配总黄酮含量占0.7，槲皮苷含量占0.3。具体计算方法为9个样品中，每一个样品的总黄酮、槲皮苷含量分别除以9个样品中总黄酮、槲皮苷含量的最大值，然后乘以权重系数，得到总黄酮、槲皮苷含量在该样本中的综合评分的贡献值，同一样品的总黄酮、槲皮苷含量贡献值之和即为该样品的综合评分[13]。因素水平见表3，试验安排及结果见表4，方差分析见表5。由表4极差分析结果可知，各因素对结果的影响顺序为C＞A＞B，即提取时间＞乙醇体积分数＞料液比。由表5方差分析可知提取时间对提取工艺有显著影响，并根据综合评分结果，选择最优工艺条件A1B3C3，即乙醇体积分数60%，料液比为1∶12，提取时间12 d。

 

表3 侧柏叶生发酒的提取工艺正交试验因素水平

 

2.4 验证试验

称取新鲜侧柏叶药材粉末各6 g，按最佳工艺条件A1B3C3重复3次试验，验证该工艺条件的稳定性，结果总黄酮的平均含量为12.56 mg/g，槲皮苷的平均含量为1.35 mg/g，结果无显著性差异，证明该工艺稳定可行。

 

表4 侧柏叶生发酒的提取工艺正交试验

 

 

表5 综合评分方差分析

 

3 讨论

白发的病因与发病机理复杂，现代医学研究认为，可能与遗传、衰老、疾病等导致的黑素干细胞衰老、黑素细胞减少等有关，机制包括bcl-2基因缺失、氧化损伤、氧化应激、微量元素缺乏等。其中，酪氨酸酶(tyrosinase)表达量减少或活性降低是一个重要的因素[14-15]。

侧柏叶中所含化学成分复杂，包括黄酮类化合物、鞣质和挥发油等，可应用于医药、农药、化妆品等领域[8]。在诸多古今文献中记载其主要功能为乌发和生发，其中最常用的方法就是将鲜侧柏叶浸泡于高浓度的酒精中，滤取药液，涂擦毛发脱落部位。但该提取工艺的参数尚缺乏实验依据，都是根据前人经验而得，本研究考察了乙醇体积分数、料液比、浸提时间对侧柏叶生发酒提取工艺的影响，优化了侧柏叶生发酒的提取工艺。

侧柏叶主要含槲皮苷、杨梅树素、扁柏双黄酮、穗花杉双黄酮等黄酮成分[16]。这些成分化学结构中都有可与铝离子生成具色络合物的供电子体。因此，本文用比色法测定侧柏叶中总黄酮成分含量。《中国药典》收录侧柏叶生品中槲皮苷的含量测定方法，本实验同时测定两者含量的变化情况，可为侧柏叶生发酒的质量控制提供科学依据。

专利资助基金主要用于奖励以湖北民族学院为独立单位专利申报、维持费用,以湖北民族学院为第一单位联合申请,由合作单位共同承担相关费用,湖北民族学院为非第一单位,学校不承担相关费用。具体费用有:专利申请费、实审费、复审费、代理费；专利维持费、公告费、证书费及印花税、专利授权的年费(发明专利年费3年；实用新型专利年费、外观设计专利年费1年)。

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