白酒黄水中提取乳酸链球菌素的研究

乳酸链球菌素（Nisin）可抑制大多数革兰氏阳性细菌，对芽孢杆菌的孢子有强烈抑制作用[1]。因此，作为食品防腐剂广泛应用于食品行业，对食品的色、香、味、口感等无不良影响，且食用后不会改变人体肠道内正常菌群，更不会与其他抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂[2]。

我去公共泳池游泳的时候，水温都达不到精子生存的温度即32～36摄氏度之间，室内的恒温泳池一般也就在26～28摄氏度。

以黄水为主的固态酿造废水中存在大量的乳酸菌[3]，乳酸菌在发酵代谢过程中除产生乳酸、乙酸等有机酸外，还产生大量的有抑菌或杀菌作用的乳酸链球菌素[4]。利用大孔吸附树脂对黄水中的乳酸链球菌素进行粗提取，研究树脂添加量、提取时间、转速、提取温度等因素对提取效果的影响，以确定乳酸链球菌素的最适合提取条件[5]，为酿酒废水的资源化利用提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌株：藤黄微球菌（酿酒生物与技术四川省重点实验室提供）。

生：我们选的是第三组小棒，也搭成功了，但搭出的长方体和第一组小棒搭出的长方体框架不一样，它有8条棱长度是相等的，4个面的大小一样。

提取：预处理后的黄水加入大孔吸附树脂（树脂使用前按照说明书预处理），置于摇床提取一定时间，收集树脂，加入80%、pH2的乙醇解吸后，收集清液旋转蒸发去溶剂，加入0.02 mol/L的盐酸溶液溶解，得到粗提液。

仪器设备：电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；分析天平，梅特勒托利多；高效液相色谱（1260），美国Agilent；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；振荡培养器，上海博讯；高温灭菌锅，上海申安。

1.2 试验方法

1.2.1 提取工艺[6-8]

预处理：将黄水粗滤，除去酒糟、稻壳等杂质，5000 r/min离心，除去沉淀。

试剂及耗材：大孔吸附树脂（NAK-Ⅱ，天津南开大学树脂有限公司），乳酸链球菌素Nisin标准品（106 IU/g，Sigma），乙腈（色谱纯，Sigma），三氟乙酸、葡萄糖、乙醇、NaCl、HCl、Na2HPO4·12H2O（AR，成都科龙化工试剂厂），琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏（BR，北京奥博星）。

1.2.2 效价测定[9-10]

（1）指示菌：藤黄微球菌

（2）营养肉汤琼脂培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%，pH7.0。

（3）效价检测培养基（g/100 mL）：蛋白胨0.8，葡萄糖0.5，酵母浸膏0.25，氯化钠0.5，琼脂粉1，1%Na2HPO4·12H2O，pH7.0，121 ℃灭菌20 min。

（4）标准曲线绘制

设计单因素试验，以提取物效价评估提取效果，分别研究树脂添加量、提取温度、提取时间、转速等条件对提取效果的影响。

将检测培养基熔化并冷却至50℃左右，用移液管移取15 mL到无菌平皿中，使其在培养基均匀涂布，放置在水平台上凝固后，作为底层平板；另取检测培养基适量，熔化后冷却至45℃左右，加入制好的菌悬液使最终浓度在107～108cfu/mL，迅速摇匀，用移液管移取5 mL在底层上均匀涂布，作为菌层。置水平台上冷却后将牛津杯均匀直立于培养基上。加入200 μL不同浓度工作液于每个牛津杯中，30℃培养24 h，测定抑菌圈直径。

（5）提取样品效价测定

取200 μL粗提液按绘制标准曲线法测定。

提取时间选择：在30℃条件下，向黄水中添加1.5%树脂，摇床100 r/min分别提取6 h、12 h、18 h、24 h、30 h。研究提取时间的影响。

1.2.3 单因素试验

准确称取100 mg Nisin标准品，溶于10 mL无菌0.02 mol/L的盐酸稀溶液中，配成104 IU/mL的Nisin储备液。取Nisin储备液，以0.02 mol/L无菌盐酸为稀释液，制备浓度为1000 IU/mL、500 IU/mL、250 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL、10 IU/mL的Nisin工作液。

以提取物效价评估提取效果，设计L9（34）正交试验进一步优化提取条件。正交试验因素与水平设计见表1。

树脂添加量选择：在30℃条件下，向黄水中分别添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%树脂，于摇床100 r/min，提取6 h。研究树脂添加量对提取效果的影响。

如图3可知，随着提取时间的延长，乳酸链球菌素的提取量逐渐增加，18～24 h范围内增加幅度较大，之后趋于平缓，说明树脂对乳酸链球菌素的吸附达到饱和。

提取温度选择：向黄水中添加1.5%树脂，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃条件下，于摇床100 r/min，提取6 h。研究温度对提取效果的影响。

式(6)等式右边为直流线路换相前后的电流之和，等式左边对应实际换相电压时间面积。当不考虑交流电压三次谐波和直流电流二次谐波时，换相角计算公式可简化为式(7)所示。

转速选择：在30℃条件下，向黄水中添加1.5%树脂，摇床分别以 50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min的转速提取6 h。研究转速对提取效果的影响。

1.2.4 正交优化

由表2可知，以脱水量(λ)为因变量，微波作用时间(χ1)、微波功率(χ2)、物料量(χ3)对本实验数据进行回归分析拟合得到脱水量的二次多项式回归方程，见式(3)：

 

表1 正交试验因素与水平

 

1.2.5 高效液相色谱条件定性[11]

粗提液用0.22 μm膜过滤后，用高效液相色谱定性。

色谱柱：C18柱，检测器：二极管阵列检测器，波长：220 nm，流速：1.5 mL/min，柱温：25 ℃，进样量50 μL，流动相：A（90%乙腈+0.1%三氟乙酸）、B（10%乙腈+0.1%三氟乙酸）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以抑菌圈直径为横坐标，乳酸链球菌素效价对数值为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。R2=0.9965，线性较好，满足试验需求。

  

图1 乳酸链球菌素标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 树脂添加量影响（见图2）

  

图2 树脂添加量对提取效果的影响

由图2可知，随着树脂添加量的增加，提取物的效价逐渐提升，说明树脂量越大，吸附的乳酸链球菌素越多。树脂添加量从0.5%到1.5%，乳酸链球菌素吸附量增加幅度较大，树脂添加量从1.5%到2.5%，乳酸链球菌素吸附量增加幅度较小。可能是因为黄水中一定量的乳酸链球菌素被树脂吸附，含量明显降低，低到一定程度，树脂无法吸附。

2.2.2 提取时间影响（见图3）

  

图3 提取时间对提取效果的影响

不一会儿，“包子西施”门前焕然一新，拱门、横幅、花篮一样不少，两位穿旗袍的礼仪小姐，对顾客点头哈腰，不停地说：“欢迎光临！欢迎光临……”老板打扮得花枝招展，对男士敬烟，给女士发糖。

溶洞中还生活着这里特有的奇异动物——洞螈。洞螈又叫盲螈，从名字中就能知道，这是一种眼睛已经退化的洞穴动物。的确，洞螈无眼睑，眼睛退化并隐藏在皮下。洞螈是一种两栖动物，身体呈灰色或粉红色。它们用鳃呼吸，而奇特的是，粉红色的鳃却长在了身体外侧，像两束小小的珊瑚。其实，鳃本身是无色透明的，美丽的粉红色实际上是血液的颜色。

2.2.3 转速影响（见图4）

  

图4 转速对提取效果的影响

如图4所示，在50～150 r/min范围内，增加转速，可以使乳酸链球菌素的提取量增加，但继续增加转速，会引起乳酸链球菌素提取量一定程度的降低，最终趋于平缓。一定范围内增加转速可以使乳酸链球菌素分子与吸附剂树脂充分接触，有利于吸附。但转速过高，可能会因机械力的作用而对吸附造成不利影响。

2.2.4 温度影响（见图5）

  

图5 温度对提取效果的影响

由图5可知，在20～40℃范围内，随着温度升高，乳酸链球菌素吸附量增多，在40～60℃范围，随着温度升高，乳酸链球菌素吸附量减少。温度升高，分子运动加剧，增加乳酸链球菌素分子与吸附剂树脂的碰撞机会，一定温度范围内升高温度，吸附量增加；但吸附本身是放热过程，温度升高，树脂的吸附能力降低。

古时每逢要举行盛大仪式，所有庄严立于祭坛前的神职人员们的盛装上总会缝着几颗大而闪烁的蓝宝石；传说拥有蓝宝石者能得到来自于天界的灵感，只要凝视着蓝宝石所绽放出的深蓝色光芒，便能涌现超人智慧，所以无论是中世纪的预言家还是今天以罗马教皇、大主教为首的神职人员或神秘学家，都将蓝宝石作为至爱和必备之物而珍藏。

2.3 正交试验结果

根据单因素试验结果，设计4因素3水平正交试验，进一步优化乳酸链球菌素的粗提取条件，正交试验结果与分析见表2。通过对比极差R可以看出，影响乳酸链球菌素提取效果的因素：树脂添加量＞提取温度＞提取时间＞转速。通过比较均值k可以看出，乳酸链球菌素最优提取条件组合为A2B2C3D3，通过验证试验发现提取条件为A2B2C3D3时，效价为572.02 IU/mL，因此乳酸链球菌素最合适提取条件为：树脂添加量1.5%，提取温度50℃，提取时间24 h，转速150 r/min。

 

表2 L9(34)正交试验结果与分析

 

2.4 高效液相色谱分析定性结果（图6、图7）

  

图6 乳酸链球菌素标准品的色谱分析

  

图7 粗提取样品的色谱分析

采用高效液相色谱对粗提取物进行定性，乳酸链球菌素标准品出峰时间在9.413 min，粗提取物在9.420 min时出现了一个特征峰，从保留时间的一致性可以初步判定粗提取物为乳酸链球菌素，但粗提取物仍存在较多杂质，需进一步纯化。

接到任务后，我立即组织了两个层次的起草工作，一个是全市近20个委办局根据十条政策起草各自相关条文和实施意见，另一个是由各委办派出得力骨干参加市里文件起草小组，包括海关组沈耀华、李秀芬，保税区组黄开旭，金融银行组姜建清，证交所组毛应梁、尉文渊，外汇组林月娥，外经贸组陈忠浩，外资组范永进，财税组顾性泉，土地组谭企坤、王安德等人。那两个月里，五加二，白加黑，日夜奋战，除了将80年代经济技术开发区、特区的具体政策条款悉数收集、一网打尽，纳入浦东新区政策外，更主要的是研究特区没有干过的五方面事项。

3 结论

通过正交试验探究了大孔吸附树脂添加量、提取时间、转速、提取温度对黄水中乳酸链球菌素粗提取的影响，结果表明影响因素的顺序为树脂添加量＞提取温度＞提取时间＞转速。乳酸链球菌素最合适提取条件为：树脂添加量1.5%，提取温度50℃，提取时间24 h，转速150 r/min，粗提取物效价为572.02 IU/mL。

参考文献：

[1]房春红,刘杰,许修宏.乳酸菌素的研究现状和发展趋势[J].中国乳品工业,2006,34(2)：53-55.

[2]权春善,徐洪涛,王军华,等.乳酸菌素——安全、天然的食品防腐剂[J].微生物学杂志,2006,26(3)：86-89.

[3]冯兴垚,邓杰,谢军,等.白酒酿造副产物黄水综合利用现状浅析[J].中国酿造,2017,36(2)：6-9.

[4]宁喜斌.乳酸菌素的特性及应用[J].上海水产大学学报,2002,11(3)：289-294.

[5]李向蓉,戴晓晴,王春晖,等.采用树脂法从剩余污泥中提取微生物絮凝剂[J].中南大学学报(自然科学版),2013,44(1)：411-416.

[6]还连栋,陈秀珠,王明华,等.从发酵液中分离提取乳链菌肽的方法：CN1293201A[P].2001-05-02.

[7]梁艳玲,苏芬芬,伍彦华,等.从大曲酒副产物黄水中提取乳酸的研究[J].酿酒科技,2017(3)：95-99.

[8]吴琼,生英涛,唐名山,等.乳酸乳球菌发酵液中乳链菌肽的分离纯化[J].食品科学,2003,24(9)：103-106.

[9]辛宇.微生物发酵工业化生产乳链菌肽的工艺研究[D].天津：河北工业大学,2005.

[10]伊守亮,肖林,顾正华,等.管碟法测定Nisin效价[J].无锡轻工大学学报,2004,23(4)：41-45.

[11]彭光杰.树脂吸附发酵分离耦合生产乳链菌肽的研究[D].西安：陕西科技大学,2015.