葡萄酒中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸及山梨酸检测方法研究

随着人们生活水平的日益提高，人们对食品安全越来越重视。目前国内葡萄酒市场的消费量也越来越大,葡萄酒中的添加剂也受到人们的重视。其中山梨酸、苯甲酸为防腐剂，在GB 15037《葡萄酒》中均有限量要求，而糖精钠、安赛蜜为人工合成甜味剂，在食品工业中日益广泛应用，但在葡萄酒中不允许添加，然而在实际生产中不法商贩超标准使用的现象时有发生，因此有必要加强对其监管和检测。使用液相色谱法，如果色谱实验条件不合适，会导致葡萄酒一些物质出峰时间与要检测的4种物质出峰时间相同，从而对检测结果产生较大的影响，导致实验数据不准确。

GB 5009.28—2016为食品中山梨酸、苯甲酸和糖精钠的测定通用方法，对于葡萄酒大批量样品检测时，前处理过程较复杂、耗时较长，本实验针对葡萄酒中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸和山梨酸的检测方法进行实验条件优化，通过实验减少了前处理的过程，节省时间及成本，对于葡萄酒生产、检测等需对大批量葡萄酒样品进行检测的机构，具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：市售葡萄酒样品，葡萄酒经0.45 μm微孔滤膜过滤。

试剂：乙酸铵（色谱纯），天津市光复精细化工研究所；甲醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；氨水（色谱纯），天津市大茂化学试剂厂；乙酸（色谱纯），天津市大茂化学试剂厂。

“ 哪儿有什么绑架。”教授低着头说道，“那个叫杰克的男孩儿现在很好，就住在我后来租的公寓里，和我们的学校只有一街之隔。”

仪器设备：Agilent1200型高效液相色谱仪（配自动进样器、二极管阵列检测器），Agilent公司；分析天平（感量0.0001 g），METTLER TOLEDO公司。

标准溶液：安赛蜜，安赛蜜溶液标准物质BW3510，1.00 mg/mL；糖精钠（CA16901010,纯度99.0%），精确称取0.100 g糖精钠标准物质，溶解转移至100 mL容量瓶中定容，浓度为1.00 mg/mL；苯甲酸，苯甲酸溶液标准物质GBW(E)100006，1.00 mg/mL；山梨酸，山梨酸溶液标准物质GBW(E)100007，1.00 mg/mL。

国标法GB 5009.28—2016适用于食品中糖精钠、苯甲酸和山梨酸3种物质的测定，通过加水提取，脱脂或经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离、检测。而葡萄酒的酒精度较低，在生产过程中要经过下胶、下皂土等澄清步骤，成品酒中已除去了酒中不稳定的蛋白质类物质。

试剂配制：乙酸铵（20 mmol/L）溶液：称取1.54 g乙酸铵，加入适量水中溶解，用水定容至1000 mL，用氨水或乙酸调整至合适的pH值，经0.45 μm水相微孔滤膜过滤后备用。

1.2 色谱条件

国标法GB 5009.28—2016进行色谱分离时，使用的流动相为甲醇∶乙酸铵溶液=5∶95。但由于葡萄酒样品内容物质众多，背景干扰较大，最终选用流动相为甲醇∶乙酸铵溶液=8∶92。通过调整乙酸铵溶液的pH值，就可以很好地对待测4种物质进行分离（如图1、图2、图3、图4）。

2 结果与分析

2.1 样品提取条件和检测项目优化

安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸混合标准工作溶液：分别准确吸取安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸标准溶液0 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL至10 mL容量瓶中，加水定容,摇匀。配制成质量浓度分别为0 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的混合标准系列工作溶液，临用现配，经0.45 μm微孔滤膜过滤。

CMA检测结果分析本病例胎儿羊水CMA检测发现10号染色体10q22.3-q23.2位置发生缺失arr 10q22.3q23.2(81,603,169-89,227,475)×1，片段大小约7.6Mb，该区域包含17个OMIM基因，包含BMPR1A(601299)、NGR3(605533)、GRID1(610659)等致病基因，具体见图1。

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但在实际葡萄酒样品检测中，不同pH值的流动相对安赛蜜和糖精钠的保留时间、峰高和峰宽的影响较小，但对山梨酸和苯甲酸的保留时间、峰高和峰宽的影响较大（如图5、表1）。

2.2 色谱条件优化

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱：4.6×250 mm，粒径5 μm；流动相：甲醇∶乙酸铵溶液=8∶92；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；进样量：10 μL；柱温：30℃。

  

图1 乙酸铵溶液pH4.81时4种物质的混标色谱图

  

图2 乙酸铵溶液pH5时4种物质的混标色谱图

实际检测过程中发现，葡萄酒可以直接进行液相色谱分离。而且增加安赛蜜标准物质后，安赛蜜、糖精钠、苯甲酸和山梨酸在现有条件下可以得到很好的分离度，因而采取对葡萄酒样品不进行前处理，直接检测4种物质的方式。

根据实际色谱分离效果，选择乙酸铵溶液pH5.20作为在葡萄酒样品中检测安赛蜜、糖精钠、苯甲酸和山梨酸的流动相条件，可以实现4种待测物质与葡萄酒中其他化合物的分离，杂质干扰少（如图6、图7、图8、图9）。

  

图3 乙酸铵溶液pH5.2时4种物质的混标色谱图

  

图4 乙酸铵溶液pH5.4时4种物质的混标色谱图

  

图5 在不同pH值流动相下4种物质的保留时间

 

表1 不同pH值流动相4种物质的峰宽 (min)

 

  

图6 乙酸铵溶液pH5.2时，红葡萄酒空白样品色谱图

  

图7 乙酸铵溶液pH5.2时，红葡萄酒加标样品色谱图

  

图8 乙酸铵溶液pH5.2时，白葡萄酒空白样品色谱图

  

图9 乙酸铵溶液pH5.2时，白葡萄酒加标样品色谱图

2.3 标准曲线

分别配制各组分浓度相等混合标准序列（20mg/L、50 mg/L、100 mg/L），进样10 μL，以峰面积和浓度进行线性回归，回归方程和相关系数见图10、图11、图12、图13。

  

图10 安赛蜜标准曲线

2.4 方法回收率和精密度实验

以红葡萄酒为例，分别吸取一定量（3个水平）的安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸标准溶液，加酒定容，配制成混合标准系列工作溶液，经液相色谱分离、检测，结果见表2。

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由表2可知，加标回收率在101.2%～106.8%之间，相对标准偏差为0.41%～3.17%（n=5）。

  

图11 糖精钠标准曲线

  

图12 苯甲酸标准曲线

  

图13 山梨酸标准曲线

 

表2 回收率与相对标准偏差(n=5)

 

3 结论

本研究在GB 5009.28—2016液相色谱法的基础上改进检测葡萄酒中安赛蜜、山梨酸、苯甲酸和糖精钠的方法，使葡萄酒样品可以直接进样，同时检测以上4种物质。在流动相pH5.20时，即可较好分离被测物质和葡萄酒中其他物质，降低对检测结果的干扰，得到了较为满意的结果。

参考文献：

[1]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定：GB 5009.28—2016[S].北京：中国标准出版社,2017.

[2]白静.高效液相色谱法测定食品中的安赛蜜[J].食品科学,2011,32(16)：245-248.

[3]河北省卫生和计划生育委员会.食品安全地方标准食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定高效液相色谱法：DBS 13/006—2016[S].2016.

[4]中华人民共和国卫生部.饮料中乙酰磺胺酸钾的测定：GB/T 5009.140—2003[S].北京：中国标准出版社,2004.