液相色谱-同位素稀释质谱法测定全蛋液中恩诺沙星

恩诺沙星 （enrofloxacin，ENR）作为畜禽养殖中常用氟喹诺酮类抗生素，其在畜禽养殖中的不规范使用，会通过食物链在人体内富集，产生一系列不良反应[1～3]，同时不利于畜禽疾病防治，危害公共安全。农业部颁布的278号、235号、560号等公告中，对氟喹诺酮类药物的残留限量及使用作出了具体要求，并配套了相关的检测方法，以确保农产品质量安全。其中，235公告规定恩诺沙星在产蛋鸡中禁用。然而近年的农业部畜禽产品风险监测结果显示，禽蛋产品中恩诺沙星药物残留的问题依旧突出。目前，测定鸡蛋中恩诺沙星等氟喹诺酮类药物的方法很多，主要有液相色谱－荧光检测法[4～7]、 液相色谱－质谱方法[8～10]等。 虽然恩诺沙星纯度、溶液标准物质已有研制报道[11～12]，但是用于评价方法的相关基体标准物质缺失。目前，针对有机成分量基体标准物质的定值研究，同位素稀释质谱法是被公认为具有绝对测定性质的高准确度定值方法，该方法可将质谱的测量直接溯源至天平的称量[13～15]。本研究以氘代恩诺沙星－D5为内标，建立了全蛋液中恩诺沙星测量的液相色谱－同位素稀释质谱法，测定鸡蛋全蛋液样品中恩诺沙星的含量，旨在为全蛋液中恩诺沙星药物残留基体标准物质的研制提供准确可靠的定值方法。

一、材料与方法

（一）实验材料　液相色谱－质谱联用仪（Waters Acquity UPLC 串联 AB TripleQuad 3500，美国）；高速冷冻离心机 （美国Thermo公司）；水浴氮吹仪 （DSY－III，北京东方精华苑科技有限公司）；涡旋振荡器 （Touch Mixer MT－51，日本Yamato公司）；色谱柱Waters X－bridge C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）。恩诺沙星标准物质 （GBW（E）090817，纯度为99.7%，农业部农产品质量标准研究中心）；恩诺沙星－D5标记物 （纯度98.5%，美国sigma）；QuECHERS净化剂次级胺PSA，石墨化碳黑GCB以及C18（上海安普公司）；鸡蛋样品为超市销售的新鲜鸡蛋；其他有机溶剂均为色谱纯试剂 （德国Merck公司）。

目前仍有许多抗血小板聚集药物正在研发，随着科技的发展将会有更多优质药物上市，作为临床医师需要娴熟掌握各种药物的药理学特点才能将更好的治疗带给患者。

（二）实验方法

1.标准溶液配制：称取10 mg恩诺沙星纯度标准物质溶解于100 mL甲醇中，配制成100 mg/L的恩诺沙星标准储备溶液，－20℃冰箱中保存；上机溶液采用逐步稀释的方法，配制5、10、20、40、80、100 μg/L的一系列标准溶液；采用同样的配制方法，配制100 mg/L恩诺沙星－D5内标储备液，并稀释至100 μg/L备用。

（四）基质效应的影响　采用提取后添加法[16]，将空白蛋液样品按前处理方法进行提取净化后，在提取液中添加20 μg/L待测物，与同样浓度的纯溶剂中待测物的离子强度进行比较，发现添加样品的离子响应为溶剂样品的0.9倍左右，说明基质对待测物的响应有一定的抑制作用，一般相对比值在0.85～1.15之间则可认为基质效应不明显。此外，本方法所采用的同位素稀释质谱法是被公认为补偿基质效应最理想的方法，因此可以不予考虑基质效应带来的影响。

某车站结构形式为地下两层双柱三跨矩形钢筋混凝土框架结构岛式车站[13]，采用明挖顺作法施工。基坑围护结构采用地下连续墙+内支撑支护形式，辅以基坑内疏干降水，地连续插入比在1∶0.4～1∶0.5之间，地下水位埋深3.1 m～4.5 m，属悬挂式止水。

为进一步研究TSCC细胞中PRKCI基因与miR-219的相互关系，我们构建了PRKCI基因的过表达载体，将miR-219基因分别转染含PRKCI基因和无义序列对照基因的SCC-15细胞，通过MTT实验、克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验都说明PRKCI能够显著逆转miR-219对TSCC细胞的增殖及发展的抑制作用。Spearman相关性分析证明，在TSCC中，PRKCI基因与miR-219的表达呈负相关。这些结果表明PRKCI基因的过表达可能与TSCC的发生及发展有关。

（三）线性考察　取恩诺沙星标准储备液，配置成 2、 5、 10、 20、 40、 80、 100 μg/L 的标准溶液，各标准溶液中均加入20 μg/L的恩诺沙星－D5同位素内标。以恩诺沙星与恩诺沙星－D5的含量比与质谱中二者的峰面积比拟合曲线，如图4所示。实验表明恩诺沙星在2～100 μg/L浓度范围具有线性良好，R＝0.999，且线性方程截距非常小，因此在实际样品测定时，可采用单点法校准。

 

表1　液相色谱洗脱程序

  

时间　流速（mL/min）A B（0.1%FA水）　（甲醇）1 2.5 3.5 5.5 7 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 955 5 5 9 5 95 95 95 5 5

 

表2　恩诺沙星及其内标物MRM离子对信息

  

碰撞能（V）恩诺沙星恩诺沙星－D5化合物　离子对（m/z）去簇电压（V）360.3/316.1 365.3/321.3 110 110 30 30

二、结果与讨论

（一）样品均质时间考察　鸡蛋由蛋黄与蛋清组成，富含磷脂、蛋白等，因此在基体标准物质研制过程中，全蛋液原料的均匀性非常关键。本研究通过向空白蛋液中添加恩诺沙星药物并磁力搅拌混匀的实验，考察了全蛋液均质时间对于全蛋液标准物质原料中恩诺沙星量值均匀性的影响 （见图1）。从图1可以看出，搅拌混匀时间小于60 min时，全蛋液中恩诺沙星测定结果波动较大，表明添加的恩诺沙星药物在全蛋液中分布不均匀造成；而当混匀时间超过60 min，测定结果趋于稳定。因此，在全蛋液基体标准物质原料制备时，磁力搅拌混匀时间应大于60 min，进而保证样品原料的均匀性。

  

图1　混匀时间对恩诺沙星量值均匀性的影响

My dear Comrades.Ihave been listening to you,amazed at the wells of faith in human beings！（1972:394）

  

图2　不同提取剂的提取效率比较

  

图3　不同净化剂的净化效果比较

4.液相色谱－质谱条件。（1）液相色谱条件：WatersX－bridge C18色谱柱 （150 mm×2.1 mm， 3.5 μm）；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇。优化洗脱程序，确定梯度洗脱程序如表1所示。（2）质谱条件：ESI离子源正离子模式，多反应离子监测 （MRM），喷雾电压4 500 V；离子源温度550℃；定量离子对信息如表2所示。

（二）前处理优化　由于样品中恩诺沙星含量较低，目标物的提取效率及样品的净化程度对结果的影响也很大。因此，在样品前处理过程中，本研究主要考察了不同提取剂与净化剂对于结果的影响。实验根据文献中常见的提取剂选择比较了甲酸化甲醇 （含甲酸1%）、甲酸化乙腈 （含甲酸1%）、乙腈水 （含乙腈90%）以及磷酸缓冲液/乙腈（1∶3）（磷酸缓冲液：0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液，5 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7）4种提取剂，提取效率如图2所示。结果表明，甲酸化乙腈的提取效率最高，达到90%以上。在QuECHERS净化时，实验发现GCB对于目标物有较强的吸附性，因此不再进行优化。根据药物分子的性质，实验重点考察了PSA与C18对于样品的净化效果。比较了PSA （30 mg、 60 mg）、 C18 （30 mg、 60 mg） 以及PSA与 C18（30 mg+30 mg）组合 5种净化方法（见图3），结果表明PSA与C18组合使用时具有较高的回收率。综上所述，最终确定了甲酸化乙腈提取剂以及PSA与C18组合净化剂。

  

图4　恩诺沙星标准曲线

 

含量比 （ENR/ENR－D5）

2.全蛋液中恩诺沙星阳性样品制备。取鲜鸡蛋约1 kg（空白样品），用电动打蛋器初步混匀后，加入适量恩诺沙星标准溶液，得到恩诺沙星鸡蛋阳性样品浓度约为20 μg/L。样品均质采用较为温和的磁力搅拌方式进行混匀，并在混匀起始过程的第5、15、30、60、90、120 min等6个时间点平行取样3次，均质充分后于搅拌状态下将蛋液封装于4 mL玻璃瓶中，－80℃冰箱保存。

在志书中，大事记与各篇章节的内容是互为详略、互为补充的关系。互为详略，是指大事记记述简明扼要，各篇章记述详细；互为补充是指一些缺失详细内容，无法在条目中详细记述,但又有一定的重要性，不能不在志书中有所反映的内容,可收录在大事记中，避免了志书重要内容的缺漏。

3.样品前处理方法。全蛋液阳性样品在4℃下解冻平衡后，充分旋混后称取1g（精确到0.01g）于15 mL聚丙烯离心管中；按照鸡蛋中恩诺沙星及标记物含量接近1∶1原则，准确量取100 μg/L的恩诺沙星－D5溶液200 μL，添加至样品中并涡旋混匀30 s，4℃下平衡1 h；平衡后加入4 mL 1%甲酸乙腈提取液提取；涡旋2 min，4℃下8 000 r/min离心10 min，取上层清液，重复提取与离心步骤，合并两次上清液，室温下氮气吹干，加入1 mL流动相复溶；复溶液中加入4 mL正己烷，5 000 r/min离心5 min，吸取下层清液加入30 mg PSA及30 mg C18净化，涡旋30 s充分混合，10 000 r/min离心5 min后取上清液过0.22 μm滤膜，上机分析。

（五）方法的检出限与定量限，准确性与精密度　本实验采用液相色谱同位素稀释质谱法，通过单点法校准，测定了制备的全蛋液中恩诺沙星含量，标准溶液与样品的离子色谱图分别见图5a和b。通过质谱自带数据处理软件计算出不同浓度恩诺沙星标准溶液的信噪比，以3倍信噪比为实验的检出限，以10倍信噪比为定量限计算出该方法的检出限与定量限分别为0.5 μg/L和2 μg/L。同时考察了方法准确性与精密度，随机抽取了4组样品，每个样品平行测定3次，测定结果见表3。实验结果显示，组间及组内的相对标准偏差均在3%以内，精密度良好，测定结果与添加量一致，方法准确可靠。

  

图5　离子色谱图

 

a－标准溶液；b－全蛋液样品

（六）回收率考察　向蛋液空白样品中加入混合标准溶液，制备添加水平为2、20和100 μg/L的添加回收样品，按所建立的方法进行测定。平行5次，每组平行测定3次，测定结果见表4。实验表明，3个不同浓度水平的回收率结果均在95%～105%之间，且相对标准偏差小于5%。

 

表3　全蛋液中恩诺沙星含量测定结果　（n=12）

  

编号总相对标准偏差1批次浓度（μg/L）平均值（μg/L）标准偏差相对标准偏差总平均值（μg/L）总标准偏差1 2 3 19.32 19.64 19.75 19.56　0.22　0.01 2 1 2 3 20.09 19.41 18.83 19.44　0.63　0.03 19.36　0.41　0.02 3 1 2 3 18.97 19.76 18.81 19.18　0.51　0.03 4 1 2 3 19.58 19.15 19.05 19.26　0.28　0.01

 

表4　恩诺沙星添加回收率实验测定结果

  

添加浓度（μg/L）平均回收率（%）相对标准偏差RSD（%）2 20 100 98.50 102.55 104.08 1.8 2.5 4.3

三、结论

本研究以恩诺沙星－D5为内标，研究了鸡蛋全蛋液中恩诺沙星准确测定所需的前处理以及液相色谱质谱条件。实验对QuEChERS前处理方法的提取剂、净化剂条件进行了选择和优化，确定酸性乙腈可以起到良好的沉淀蛋白以及提取目标物的效果，C18和PSA的组合达到最佳的净化效果。其次，对色谱柱、洗脱程序、去簇电压、碰撞能等液质条件进行优化。最终确定的ID－MS方法，样品前处理简单，检测灵敏度高，适用于基体标准物质定值研究。

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